Structural basis of activation of a novel tumor progression signaling involving Wnt signaling proteins and supression by antibodies.

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R4年度は，研究計画調書に記した４項目のうち主に以下の３項目，① CKAP4-DKK複合体の構造解析，② CKAP4細胞外領域全体の構造解析，③ CKAP4-抗体フラグメント複合体の構造解析について研究を遂行した。以下にこれまでの結果について概要を示す。① CKAP4とDKK cysteine rich domain (DKK_CRD1)試料をそれぞれ別々に調製したものを混合し結晶化スクリーニングキットを用いて結晶化条件の検討を行ったところ，１条件において結晶が得られた。② CKAP4細胞外領域（128-602）のうち，431-602の領域について新たに発現系を構築し，結晶を得ることができた。放射光施設において回折実験を行ったところ，約 4オングストローム分解能のデータを得ることに成功した。③ ４種類の抗CKAP4モノクローナル抗体のFabフラグメントとCKAP4細胞外領域との複合体を調製した。結晶化スクリーニングを行うために十分な量の複合体試料を得ることが困難であったため，結晶構造解析法よりも少量での構造解析が可能なクライオ電子顕微鏡による単粒子解析を目指して測定を行った。その結果，ほとんどの粒子がグリッド上で気液界面に集合していることが判明した。得られた画像データから単粒子解析を行ったが，明瞭な三次元再構成像を得ることが困難であった。二次元でのクラスタリングではCKAP4-Fab複合体と思われる像が得られたため，グリッド作成法の検討により明瞭な三次元再構成像を得ることは可能であると思われる。