リン脂質の非対称分布の分子機構と生理機能の解明

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フリッパーゼであるATP8A1とATP11BをATP11A-ATP11C二重欠損細胞の遺伝背景において欠損させ(四重欠損細胞)、定常状態で細胞膜のホスファチジルセリン(PS)が露出するかを確認した。その結果、既知のPSフリッパーゼをすべて失ったフリッパーゼ四重欠損細胞は、依然として細胞膜のPSの非対称分布を樹立することが明らかとなった。本年度では、この四重フリッパーゼ欠損細胞株を用いて、Genome-wide CRISPR/Cas9法を用いた機能スクリーニングを行った。具体的に、四重欠損細胞に、約21000の遺伝子を標的にしたCRISPR/Cas9 sgRNAライブラリーを組み込んだウイルスを感染させ、各種遺伝子を破壊する。次いで、定常状態においてPSの非対称性が崩壊し、PSを表面に露出した変異細胞をセルソーターで分取し、どの遺伝子が欠損しているかを明らかにした。四重フリッパーゼ欠損細胞を用いた上述のスクリーニングの結果、候補分子の同定(PS regulator: PSReg)に成功した。本年度は、PSRegの解析を中心に行なった。その結果、PSRegが小胞体に存在すること、複数の分子からなる複合体を形成していることを見出した。PSRegがどのように細胞膜PSの分布を制御するのかその分子機構をさらに明らかにしていくことを目指す。さらに、前年度に同定できたホスファチジルコリン制御分子(PC regulator: PCReg)の解析も行なった。その結果、PCRegが細胞膜に局在すること、PSRegのような複数の分子からなる複合体を形成していないことが見出された。