エンハンサーによる多次元的制御能を標的としたCTL賦活化リプログラミング

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① 疲弊化CTLレポーター細胞株、Tregレポーター細胞株をそれぞれ新たに3種類ずつ作製した後述する通り、前年度までの研究で作製したレポーター細胞株（BW5147・CRISPRa/i-IL2-GFP, BW5147・CRISPRa/i-Foxp3-GFP）を用いたスクリーニングにより、CTLの疲弊化マーカー・PD-1の発現やTregマーカー・Foxp3の発現制御に寄与するクロマチン候補領域を複数見出しているが、内在性マーカーの発現をより忠実に反映するため、CRISPRa/i・IFN-g-GFPマウスから取得したプライマリー疲弊化CTL,およびCRISPRa/i・Foxp3-KIマウスから取得したプライマリーTh1細胞とBW5147細胞を融合し不死化させた、新たなレポーター細胞株をPEG法により作製した。②　レポーター細胞株を用いたgRNAスクリーニングを進め、疲弊化CTLにおけるPD-1発現誘導やTh1細胞でのFoxp3発現抑制に寄与しているクロマチン候補領域を見出したBW5147・CRISPRa/i-IL2-GFPに対しては疲弊化CTLおよび活性化CTL、BW5147・CRISPRa/i-Foxp3-GFPレポーター細胞株に対してはTregから、それぞれ取得したヌクレアーゼ高感受性ゲノム領域gRNAライブラリーを導入した（スクリーニング操作）。それぞれPD-1発現低下細胞、Foxp3発現亢進細胞をソーティングにより取得し、細胞からライブラリーを回収し、２次ライブラリーを構築するというステップを3回繰り返した。このステップを経たライブラリー（４次ライブラリー）は、１次ライブラリーと比較し、PD-1発現やFoxp3発現を亢進に導く効率が著明に著明に上昇しており、目的のエピジェネティック変化を引き起こすクローンが著明に濃縮されている可能性が強く示唆される結果が得られている。