エンハンサーによる多次元的制御能を標的としたCTL賦活化リプログラミング

通过增强子实现多维可控性的 CTL 激活重编程

• 批准号: 21H02756
• 负责人: 関谷 高史
• 金额: $ 11.07万
• 依托单位: National Center for Global Health and Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02756/
• 关键词: 免疫学; 癌免疫; エピジェネティクス; ゲノム編集; 細胞リプログラミング; 抗腫瘍免疫; 腫瘍免疫

① 疲弊化CTLレポーター細胞株、Tregレポーター細胞株をそれぞれ新たに3種類ずつ作製した後述する通り、前年度までの研究で作製したレポーター細胞株（BW5147・CRISPRa/i-IL2-GFP, BW5147・CRISPRa/i-Foxp3-GFP）を用いたスクリーニングにより、CTLの疲弊化マーカー・PD-1の発現やTregマーカー・Foxp3の発現制御に寄与するクロマチン候補領域を複数見出しているが、内在性マーカーの発現をより忠実に反映するため、CRISPRa/i・IFN-g-GFPマウスから取得したプライマリー疲弊化CTL,およびCRISPRa/i・Foxp3-KIマウスから取得したプライマリーTh1細胞とBW5147細胞を融合し不死化させた、新たなレポーター細胞株をPEG法により作製した。②　レポーター細胞株を用いたgRNAスクリーニングを進め、疲弊化CTLにおけるPD-1発現誘導やTh1細胞でのFoxp3発現抑制に寄与しているクロマチン候補領域を見出したBW5147・CRISPRa/i-IL2-GFPに対しては疲弊化CTLおよび活性化CTL、BW5147・CRISPRa/i-Foxp3-GFPレポーター細胞株に対してはTregから、それぞれ取得したヌクレアーゼ高感受性ゲノム領域gRNAライブラリーを導入した（スクリーニング操作）。それぞれPD-1発現低下細胞、Foxp3発現亢進細胞をソーティングにより取得し、細胞からライブラリーを回収し、２次ライブラリーを構築するというステップを3回繰り返した。このステップを経たライブラリー（４次ライブラリー）は、１次ライブラリーと比較し、PD-1発現やFoxp3発現を亢進に導く効率が著明に著明に上昇しており、目的のエピジェネティック変化を引き起こすクローンが著明に濃縮されている可能性が強く示唆される結果が得られている。

1）在上一年中产生了三种新型的耗尽的CTL记者细胞系和Treg报告基细胞系，如下所述，如下所述，在上一年的研究中，在使用BW5147 CRISPRA/I-FOX PHOM-GFP进行筛选的研究中，在上一年的研究中生成的记者细胞系（BW5147，CRISPRA/I-IL2-GFP），该研究均通过筛选来进行。耗尽标记，PD-1和Treg标记的表达，Foxp3。但是，为了更忠实地反映内源性标记的表达，PEG创建了一个新的记者细胞系，其中从CRISPRA/I IFN-G-GFP小鼠获得的主要耗尽C​​TL和从CRISPRA/I FOXPRA/I FOXP3-KI小鼠获得的主要TH1细胞中获得的主要CTL被融合，以使BW5147细胞永生化。 ②我们使用记者细胞系进行了GRNA筛查，并引入了从BW5147 CRISPRA/I-I-IL2-GFP获得的核酸酶敏感的基因组区域GRNA库，该培养基发现了候​​选染色体区域，这些候选染色质区域有助于在耗尽的CTL中诱导PD-1的表达，并抑制了THS的FOX1和Th11111111111111111111111111111111111111111111111111111111114 CRISPRA/I-FOXP3-GFP记者细胞系（筛选程序）。通过排序获得了PD-1表达降低的细胞，而FOXP3表达增加的细胞则从细胞中收集了库，并构建了三次次级文库。与主要图书馆相比，经历此步骤的文库（第四个文库）在导致PD-1和FOXP3表达的增加方面显着提高了效率，从而强烈建议引起目标表观遗传变化的克隆显着富集。

项目成果

Tonic TCR and IL-1b signaling mediate momentary and durable phenotypic alterations in naive CD4+ T cells

Tonic TCR 和 IL-1b 信号传导介导初始 CD4 T 细胞的瞬时和持久表型改变

• 发表时间: 2022
• 作者: Takashi Sekiya;Hidenori Kasahara;Ryo Takemura;Shinya Fujita;Jun Kato;Noriko Doki;Yuta Katayama;Yukiyasu Ozawa;Satoru Takada;Tetsuya Eto;Takahiro Fukuda;Tatsuo Ichinohe;Minoko Takanashi;Makoto Onizuka;Yoshiko Atsuta;Shinichiro Okamoto;Akihi;松村 寛行;関谷 高史
• 通讯作者: 関谷 高史

Estimation of Sensitization Status in Renal Transplant Recipients by Assessing Indirect Pathway CD4+ T Cell Response to Donor Cell-pulsed Dendritic Cell

通过评估间接途径 CD4 T 细胞对供体细胞脉冲树突状细胞的反应来估计肾移植受者的致敏状态

• DOI: 10.1097/tp.0000000000004491
• 发表时间: 2023
• 期刊: Transplantation
• 影响因子: 6.2
• 作者: Kenta Iwasaki;Toshihide Tomosugi;Takashi Sekiya;Shintaro Sakamoto;Yuko Miwa;Manabu Okada;Takahisa Hiramitsu;Norihiko Goto;Shunji Narumi;Yoshihiko Watarai;Mai Okumura;Satoshi Ashimine;Kohei Ishiyama;Ezzelarab Mohamed B.;Takaaki Kobayashi
• 通讯作者: Takaaki Kobayashi

Nr4aによるTh/Tregのバランス制御と炎症性疾患

Nr4a 的 Th/Treg 平衡调节与炎症性疾病

• 发表时间: 2021
• 作者: Shiraki;H.;Tanaka;S.;Guo;Y.;Harada;K.;Hide;I;Yasuda;T. and Sakai;N;関谷 高史
• 通讯作者: 関谷 高史

Essential Roles of the Transcription Factor NR4A1 in Regulatory T Cell Differentiation under the Influence of Immunosuppressants

• DOI: 10.4049/jimmunol.2100808
• 发表时间: 2022-04
• 期刊: The Journal of Immunology
• 作者: T. Sekiya;H. Kasahara;Ryo Takemura;S. Fujita;J. Kato;N. Doki;Y. Katayama;Y. Ozawa;S. Takada;T. Eto;T. Fukuda;T. Ichinohe;M. Takanashi;M. Onizuka;Y. Atsuta;S. Okamoto;A. Yoshimura;S. Takaki;T. Mori