ゲノム編集ツール臓器内直接送達システムによる生体内ダイレクトゲノム編集技術の開発

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本研究は、ゲノム編集ツールCRISPR-Cas9複合体（リボヌクレオプロテインRNP）を標的臓器細胞内へ直接送達可能な新規物理的送達システムの開発により、安全で効率的な生体内ダイレクトゲノム編集技術の確立を目的とする。研究代表者は、皮膚表面から微弱電流による皮内薬物送達技術（イオントフォレシスItP）により、皮膚のみならず肝臓表面からの直接的なsiRNA送達による遺伝子発現抑制に成功したことで、ItPによるin vivoダイレクトゲノム編集を発想した。だが巨大なRNPのItPには、臓器・細胞内送達の技術革新が必須なため、本研究ではRNPの臓器内浸透、細胞内取込とエンドソーム脱出の達成により、in vivoダイレクトゲノム編集技術を確立し、疾患モデルでの治療効果の検証から本システムの完成を目指す。本年度は、①肝臓表面ItPによる臓器内核酸医薬送達メカニズムの検証（in vivo）、②RNPの微弱電流による細胞内送達とゲノム編集の詳細な条件検討（in vitro）、③CRISPRのItPによる肝臓内送達の検証（in vivo）、を実施した。①は、ItPによって肝臓組織細胞の細胞骨格が、皮膚細胞と同様に変化するのか否かを調べるため、ファロイジンを用いItP処理したマウス肝臓切片の重合化アクチンを染色したところ、ファロイジン蛍光が減少したことから、皮膚と同様に微弱電流によって重合化アクチンの脱重合促進が確認できた。②は、微弱電流処理48時間後にT7E1アッセイを行いゲノム編集を評価したところ、クロロキン共存下で切断バンドと思われるものが得られたが、毒性も見られたため、クロロキン濃度と処理時間、評価時間を詳細に検討した。③は、蛍光標識CRISPRを用い、肝臓表面でItPを実施し、肝臓切片の共焦点レーザー顕微鏡観察によりItPによる肝臓内へのCRISPRタンパク質の送達を確認した。