ゲノム編集ツール臓器内直接送達システムによる生体内ダイレクトゲノム編集技術の開発

利用基因组编辑工具器官内直接递送系统开发体内直接基因组编辑技术

• 批准号: 21H03797
• 负责人: 小暮 健太朗
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H03797/
• 关键词: 微弱電流; イオントフォレシス; ゲノム編集

本研究は、ゲノム編集ツールCRISPR-Cas9複合体（リボヌクレオプロテインRNP）を標的臓器細胞内へ直接送達可能な新規物理的送達システムの開発により、安全で効率的な生体内ダイレクトゲノム編集技術の確立を目的とする。研究代表者は、皮膚表面から微弱電流による皮内薬物送達技術（イオントフォレシスItP）により、皮膚のみならず肝臓表面からの直接的なsiRNA送達による遺伝子発現抑制に成功したことで、ItPによるin vivoダイレクトゲノム編集を発想した。だが巨大なRNPのItPには、臓器・細胞内送達の技術革新が必須なため、本研究ではRNPの臓器内浸透、細胞内取込とエンドソーム脱出の達成により、in vivoダイレクトゲノム編集技術を確立し、疾患モデルでの治療効果の検証から本システムの完成を目指す。本年度は、①肝臓表面ItPによる臓器内核酸医薬送達メカニズムの検証（in vivo）、②RNPの微弱電流による細胞内送達とゲノム編集の詳細な条件検討（in vitro）、③CRISPRのItPによる肝臓内送達の検証（in vivo）、を実施した。①は、ItPによって肝臓組織細胞の細胞骨格が、皮膚細胞と同様に変化するのか否かを調べるため、ファロイジンを用いItP処理したマウス肝臓切片の重合化アクチンを染色したところ、ファロイジン蛍光が減少したことから、皮膚と同様に微弱電流によって重合化アクチンの脱重合促進が確認できた。②は、微弱電流処理48時間後にT7E1アッセイを行いゲノム編集を評価したところ、クロロキン共存下で切断バンドと思われるものが得られたが、毒性も見られたため、クロロキン濃度と処理時間、評価時間を詳細に検討した。③は、蛍光標識CRISPRを用い、肝臓表面でItPを実施し、肝臓切片の共焦点レーザー顕微鏡観察によりItPによる肝臓内へのCRISPRタンパク質の送達を確認した。

Compiling ツ は, this study ゲ ノ ム ー ル CRISPR - Cas9 complex (リ ボ ヌ ク レ オ プ ロ テ イ ン RNP) へ viscera を target cell direct service may な new rules on physical delivery シ ス テ ム の open 発 に よ り, safety で sharper rate な born in vivo ダ イ レ ク ト ゲ ノ compiling technology ム の establish を purpose と す る. Research representatives は, skin surface か ら weak current に よ る intradermal 薬 content delivery technology (イ オ ン ト フ ォ レ シ ス ItP) に よ り, skin の み な ら ず routine liver surface か ら の direct な siRNA delivery に よ る heritage 伝 son 発 now inhibit に success し た こ と で, ItP に よ る in vivo ダ イ レ ク ト ゲ ノ compiling を ム 発 think し た. だ が huge な RNP の ItP に は, viscera, cells delivered within の が technological innovation must be な た め, this study で は RNP の viscera penetration, cells take 込 と エ ン ド ソ ー ム out の reached に よ り, in Vivo ダ イ レ ク ト ゲ ノ compiling technology ム を establish し, sickness, モ デ ル で の treatment services fruit の 検 card か ら this シ ス テ ム の complete を refers す. は, (1) this year is crucial liver surface ItP に よ る viscera nucleic acid within the medical 薬 served メ カ ニ ズ ム の 検 certificate (in vivo), (2) the RNP の weak current に よ る intracellular delivery と ゲ ノ compiling の ム detailed 検 な conditions for (in vitro), (3) CRISPR の ItP に よ る routine liver delivered within の 検 certificate (in vivo), を, jishi, た. は, ItP に よ っ て routine liver tissue と bone が の cells, skin cells with others に variations change す る の か no か を adjustable べ る た め, フ ァ ロ イ ジ ン を with い ItP 処 Richard し た マ ウ ス routine liver biopsy の overlap the ア ク チ ン を dyeing し た と こ ろ, フ ァ ロ イ ジ ン 蛍 light が reduce し た こ と か ら, skin と with others in weak current に に よ っ て overlap To promote が confirmation で た た た. (2) は, weak current 処 after 48 time に T7E1 ア ッ セ イ を line い ゲ ノ compiling を ム review 価 し た と こ ろ, ク ロ ロ キ ン coexist under で cut バ ン ド と think わ れ る も の が have ら れ た が, toxic も see ら れ た た め, ク ロ ロ キ ン concentration と 処 manage time, review 価 を detailed に beg し 検 た. (3) は 蛍 light logo CRISPR を with い routine, liver surface で ItP を be し shi, a routine liver biopsy の focus レ ー ザ ー 顕 micromirror 観 examine に よ り ItP に よ る within a routine liver へ の CRISPR タ ン パ ク qualitative の served を confirm し た.

项目成果

Iontophoresis-mediated direct delivery of nucleic acid therapeutics, without use of carriers, to internal organs via non-blood circulatory pathways

• DOI: 10.1016/j.jconrel.2022.01.052
• 发表时间: 2022-02-09
• 期刊: JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE
• 影响因子: 10.8
• 作者: Hasan, Mahadi;Fukuta, Tatsuya;Kogure, Kentaro
• 通讯作者: Kogure, Kentaro

イオントフォレシスによる核酸医薬の肝臓内送達

通过离子电渗疗法进行核酸药物的肝内递送

• 发表时间: 2022
• 作者: 小暮健太朗;井上慎也;福田達也;Hasan Mahadi
• 通讯作者: Hasan Mahadi

Iontophoresis-mediated direct delivery of nucleic acid therapeutics to internal organs via non-blood circulatory pathways

离子电渗介导的核酸治疗剂通过非血液循环途径直接递送至内脏器官

• 发表时间: 2022
• 作者: Kogure K;Fukuta T;Inoue S;Hasan M
• 通讯作者: Hasan M