肺炎クラミジア遺伝子機能解析の為の遺伝子破壊株ライブラリの作製

创建用于肺炎衣原体基因功能分析的基因破坏文库

• 批准号: 19K16660
• 负责人: 清水 章文
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Fukuoka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K16660/
• 关键词: 肺炎クラミジア; グループIIイントロン; 遺伝子改変; プラスミドベクター; グループII イントロン; CRISPR/dCas9

肺炎クラミジアにおける遺伝子破壊株ライブラリの作製を目的として、肺炎クラミジア遺伝子破壊用のプラスミドベクターの作製を行ってきた。昨年度は樹立した遺伝子破壊用プラスミドベクターの機能確認を実施するとともに、遺伝子破壊を実施する肺炎クラミジア遺伝子リストを作成してそれらの遺伝子破壊用プラスミドベクターライブラリの作製を実施する計画であった。現在、目的とする遺伝子破壊用プラスミドベクターと遺伝子再導入用プラスミドベクターの作製が進み、目的とするプラスミドベクターの作製が完了している。そのプラスミドベクターが目的通りに機能するかについて電気穿孔法による形質導入を試みた。遺伝子破壊用プラスミドベクターについて、機能既知の肺炎クラミジア遺伝子incAを破壊する遺伝子破壊ベクターを作製し、形質転換を実施した。その際、使用する肺炎クラミジアの血清型としては、本研究で予定していた血清型AR-39株から血清型CWL092株へと変更している。変更の理由としては、肺炎クラミジアの血清型AR-39株は溶原化バクテリオファージを保有しており、遺伝学的実験におけるバイアスとなりかねない為溶原化バクテリオファージを保有していない血清型CWL029株を用いることとした。電気穿孔法による導入の後に実施する選択培養において、β-ラクタマーゼ遺伝子及びクロラムフェニコールアセチル基転移酵素の2種類どちらかを導入し、ペニシリンG終濃度10U/ml、もしくはクロラムフェニコール終濃度2μg/mlを添加して培養している。現在までに形質転換後５継代以降の時点において薬剤選択培養後に生存する肺炎クラミジアクローンは得られていない。

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