肺炎クラミジア遺伝子機能解析の為の遺伝子破壊株ライブラリの作製

创建用于肺炎衣原体基因功能分析的基因破坏文库

• 批准号: 19K16660
• 负责人: 清水 章文
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Fukuoka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K16660/
• 关键词: 肺炎クラミジア; グループIIイントロン; 遺伝子改変; プラスミドベクター; グループII イントロン; CRISPR/dCas9

肺炎クラミジアにおける遺伝子破壊株ライブラリの作製を目的として、肺炎クラミジア遺伝子破壊用のプラスミドベクターの作製を行ってきた。昨年度は樹立した遺伝子破壊用プラスミドベクターの機能確認を実施するとともに、遺伝子破壊を実施する肺炎クラミジア遺伝子リストを作成してそれらの遺伝子破壊用プラスミドベクターライブラリの作製を実施する計画であった。現在、目的とする遺伝子破壊用プラスミドベクターと遺伝子再導入用プラスミドベクターの作製が進み、目的とするプラスミドベクターの作製が完了している。そのプラスミドベクターが目的通りに機能するかについて電気穿孔法による形質導入を試みた。遺伝子破壊用プラスミドベクターについて、機能既知の肺炎クラミジア遺伝子incAを破壊する遺伝子破壊ベクターを作製し、形質転換を実施した。その際、使用する肺炎クラミジアの血清型としては、本研究で予定していた血清型AR-39株から血清型CWL092株へと変更している。変更の理由としては、肺炎クラミジアの血清型AR-39株は溶原化バクテリオファージを保有しており、遺伝学的実験におけるバイアスとなりかねない為溶原化バクテリオファージを保有していない血清型CWL029株を用いることとした。電気穿孔法による導入の後に実施する選択培養において、β-ラクタマーゼ遺伝子及びクロラムフェニコールアセチル基転移酵素の2種類どちらかを導入し、ペニシリンG終濃度10U/ml、もしくはクロラムフェニコール終濃度2μg/mlを添加して培養している。現在までに形質転換後５継代以降の時点において薬剤選択培養後に生存する肺炎クラミジアクローンは得られていない。

为了在衣原体肺炎中建立基因破坏菌株的库，已经准备好肺炎衣原体中的基因破坏的质粒载体。去年，该公司计划确认已确定的基因破坏基因的质粒矢量的功能，并创建基因干扰基因的列表，肺炎衣原体基因进行基因破坏，并创建质粒矢量库来破坏这些基因这些基因。目前，靶基因破坏质粒载体和靶基因重新引入质粒载体的产生已经进展，靶质粒载体的产生已经完成。我们试图通过电穿孔来转导质粒载体，以查看质粒载体是否按需功能。对于基因破坏质粒载体，制备了破坏已知功能性衣原体肺炎基因INCA的基因破坏载体，并转化了基因。目前，所使用的肺炎衣原体的血清型从计划的血清型AR-39菌株更改为血清型CWL092菌株。发生这种变化的原因是，肺炎衣原体的血清型AR-39菌株带有溶裂性噬菌体，并可能在遗传实验中偏置，因此我们决定使用不带溶酶基因性细菌噬细胞的血清型CWL029菌株。在通过电穿孔引入后进行的选择性培养物中，引入了两种类型的β-内酰胺酶基因和氯霉素乙酰转移酶，并以青霉素G终浓度为10 U/mL或氯霉素终浓度为2μg/mL。迄今为止，尚未获得肺炎衣原体，在转化后通过第5通道后的时间点，在选择性药物培养后生存。