Development of DMD infiltrating Treg-Based Genome Editing Delivery Device

点击翻译按钮获取中文摘要

本研究はTregを細胞送達媒体としてゲノム編集酵素をコードしたAAVを筋損傷部位で直接生産させ、変異ジストロフィン遺伝子をエキソンスキッピングにより修復することを最終目的としている。まずT細胞を筋損傷部位に集積させるメカニズムの一つとして特異的TCRの発現の同定を試みた。マウス下肢筋損傷部位に集積するT細胞群を回収し、RNA-seqによるTCRレパトア解析を行ったところ、特定のTCRα配列を持つT細胞が偏在していることがわかった。一方でTCRβには偏りが見られなかった。次に、この特定TCR群をEF1αプロモーター下に2Aペプチド配列を挟んで組み込み、デュアル発現ベクターを作成した。次に、導入するTregまたはT細胞群素材を得る手段を検討した。生体から回収する方法の代替として、マウスES細胞からの誘導系を改良して用いた。OP9-DL1細胞共培養にFlt3lおよびIL7を添加する従来の誘導法に、ES細胞側へのFoxP3またはBcl-xLの過剰発現を併用した。これらにより、誘導後20日でCD4およびCD8両陽性の細胞集団をより効率よく得ることができ、移植に必要な量のT細胞送達媒体の確保が可能となった。これらの知見によりT細胞を送達媒体として用いる基盤が得られ、今後はAAVを搭載した状態で改変T細胞群のマウス組織内における集積・増殖能の機能評価を進めていく。また、AAVにCas9およびgRNA発現配列をコードしたものを用いて標的組織での局所的ゲノム編集の評価も行っていく。