Fluorescence-regulating techniques reveal translocation mechanisms of metabolism-related proteins

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前年度までの研究で、遊離状態では非蛍光性で、PYPタグをラベル化することで、蛍光強度が上昇し、PYPタグが分解すると蛍光強度が低下するOFF-ON-OFF型蛍光プローブの開発に成功している。この蛍光プローブは、PYPタグのリガンドとして7-ヒドロキシクマリン、蛍光色素としてフルオレセイン、脱離基としてジニトロベンゼンを導入した構造を持つ。遊離状態では、脱離基と色素が会合し、コンタクトクエンチングを引き起こすが、ラベル化するとその会合が解消され蛍光強度が上昇する。一方、タンパク質が分解すると色素はリガンドと会合し蛍光強度が抑制される原理を持つ。この原理が、フルオレセイン以外の色素に対しても応用できるかどうかを検証した。色素として、TAMRA、およびRhodolをプローブに導入したところ、それぞれのプローブは、遊離状態では非蛍光性で、PYPタグをラベル化すると蛍光強度が上昇し、タンパク質分解により蛍光強度が再度減少することが分かった。本年度は、更に、環境応答性蛍光色素を有する7-ジメチルアミノクマリンをPYPタグリガンドとして、PYPタグとより効率的に共有結合し、蛍光強度が上昇したうえ、タンパク質の分解に伴い蛍光強度が低下するプローブの開発にも取り組んだ。このプローブのラベル化速度や安定性を上昇させるために、PYPタグの反応部位でもあるCysに結合する新たな反応基であるクロロメチルケトンを持つ分子を開発した。さらには、色素の明るさを向上させるために、クマリンのジメチルアミノ基をアゼチジンに変更したプローブの開発を行った。これらのプローブの有機合成を行い、PYPタグと反応するかを検証したところ、ラベル化反応が進行し、それに伴い蛍光強度が上昇することが分かった。以上の結果は、タンパク質のマルチカラーイメージングに展開し、新たなラベル化ツールを提供するものである。