Structural basis of the iron-sulfur cluster biogenesis, and the establishment of ex-situ reconstitution system

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鉄硫黄クラスター(Fe-S)は、酸素に脆弱なタンパク質コファクターである。Fe-Sクラスターは単純な構造だが、この生合成にはSUFマシナリーと呼ばれる大掛かり な蛋白質群を必要とする。本研究課題ではその"心臓部"といえるSufBCD複合体に焦点をあてる。この複合体は ATP 加水分解に共役して、鉄と硫黄原子をFe-Sクラスター へ変換する。本研究の目的は、酸素に不安定なFe-Sクラスター合成超複合体の作動メカニズムの全容解明である。また、窒素条件および低酸素条件を感知するタンパク質CnfRに関して、構造機能解析を進める。本年度は以下の項目を実施した。(i)合成途上Fe-Sクラスター結合状態のSufBCD複合体の大量精製および結晶化スクリーニング：無酸素チャンバー内で精製することで、Fe-Sクラスター結合状態のコア複合体を得ることができている。無酸素条件下で稼働しているロボットを用いて、結晶化条件スクリーニングを行った。ATPアナログなどの添加剤、タンパク質濃度、温度など、これまでに7000条件以上のスクリーニングを実施した。得られた微結晶に関しては、大型放射光施設SPring-8にて回折能のチェックを行った。(ii)SufBCD複合体の構造変化状態の補足：これまでの成果により、SufBCD複合体に変異を導入し、ATPおよび酸化剤存在下において複合体の構造変化をロックすることに成功している。この変異SufBCD複合体をもちいて構造変化をロックした状態でのクライオ電子顕微鏡解析（東北大学）を進め、粒子動画の収集を完了した。(iii) 窒素固定のマスターレギュレーターCnfRの構造解析: 精製したCnfRの結晶化スクリーニングを行い、微結晶を得ることができた。大型放射光施設SPring-8にて、得られた結晶の回折能のチェックを行った。