Structural basis of the iron-sulfur cluster biogenesis, and the establishment of ex-situ reconstitution system

铁硫团簇生物发生的结构基础及异位重构体系的建立

• 批准号: 20H03196
• 负责人: 和田 啓
• 金额: $ 11.4万
• 依托单位: University of Miyazaki
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20H03196/
• 关键词: 鉄硫黄クラスター; X線結晶構造解析; クライオ電子顕微鏡解析; 無酸素環境実験; 窒素固定; 立体構造; 窒素固定遺伝子群; ATPase

鉄硫黄クラスター(Fe-S)は、酸素に脆弱なタンパク質コファクターである。Fe-Sクラスターは単純な構造だが、この生合成にはSUFマシナリーと呼ばれる大掛かり な蛋白質群を必要とする。本研究課題ではその"心臓部"といえるSufBCD複合体に焦点をあてる。この複合体は ATP 加水分解に共役して、鉄と硫黄原子をFe-Sクラスター へ変換する。本研究の目的は、酸素に不安定なFe-Sクラスター合成超複合体の作動メカニズムの全容解明である。また、窒素条件および低酸素条件を感知するタンパク質CnfRに関して、構造機能解析を進める。本年度は以下の項目を実施した。(i)合成途上Fe-Sクラスター結合状態のSufBCD複合体の大量精製および結晶化スクリーニング：無酸素チャンバー内で精製することで、Fe-Sクラスター結合状態のコア複合体を得ることができている。無酸素条件下で稼働しているロボットを用いて、結晶化条件スクリーニングを行った。ATPアナログなどの添加剤、タンパク質濃度、温度など、これまでに7000条件以上のスクリーニングを実施した。得られた微結晶に関しては、大型放射光施設SPring-8にて回折能のチェックを行った。(ii)SufBCD複合体の構造変化状態の補足：これまでの成果により、SufBCD複合体に変異を導入し、ATPおよび酸化剤存在下において複合体の構造変化をロックすることに成功している。この変異SufBCD複合体をもちいて構造変化をロックした状態でのクライオ電子顕微鏡解析（東北大学）を進め、粒子動画の収集を完了した。(iii) 窒素固定のマスターレギュレーターCnfRの構造解析: 精製したCnfRの結晶化スクリーニングを行い、微結晶を得ることができた。大型放射光施設SPring-8にて、得られた結晶の回折能のチェックを行った。

Iron Sulfur (Fe-S), Acid (Fe-S), Fragile (Fe-S) Fe-S is a pure protein group, which is essential for protein synthesis. This study focuses on the "heart" of the complex. The complex is composed of ATP, iron and sulfur atoms. The purpose of this study is to clarify the behavior of the Fe-S complex. The analysis of structural function and quality of CnfR is carried out under the condition of low acid content and low oxygen content. The following projects were implemented during the year: (i)On the way to synthesis, the purification and crystallization of a large amount of a SufBCD complex in a Fe-S complex bound state: an acid-free element is purified in a large amount, and a Fe-S complex in a Fe-S complex bound state is obtained. In the absence of acid, the crystallization conditions are different. ATP is used to adjust the additive, mass concentration, temperature, and temperature above 7000 ° C. The micro-crystal structure of SPring-8 was obtained. (ii) Complement of structural transformation state of SufBCD complex: the results of this study were successful in introducing different structural transformation states of SufBCD complex in the presence of ATP and acidifying agents. The structure of the different BCD complexes is changed. The electron microscope analysis (Tohoku University) is advanced. The collection of particle animation is completed. (iii)The structure analysis of CnfR: refining CnfR crystallization, microcrystallization SPring-8, a large radiation facility, was used to obtain crystalline and reflective energy.

项目成果

Evidence for dynamic in vivo interconversion of the conformational states of IscU during iron?sulfur cluster biosynthesis

铁硫簇生物合成过程中 IscU 构象状态动态体内相互转化的证据

• DOI: 10.1111/mmi.14646
• 发表时间: 2020
• 期刊: Molecular Microbiology
• 影响因子: 3.6
• 作者: Sato Sakiko;Matsushima Yumeka;Kanazawa Miaki;Tanaka Naoyuki;Fujishiro Takashi;Kunichika Kouhei;Nakamura Ryosuke;Tomioka Hiroaki;Wada Kei;Takahashi Yasuhiro
• 通讯作者: Takahashi Yasuhiro

産業・創薬展開を目指した微生物由来グルタチオン分解酵素の立体構造解析

用于工业和药物发现开发的微生物谷胱甘肽降解酶的三维结构分析

• 发表时间: 2021
• 作者: 深野紗代;小林進太郎;前川直也;高橋侑嗣;苅和宏明;今内覚;好井健太朗;原田俊之，瀧口朝陽，前澤誠希，高橋 圭，チェンバーズ・ジェームス，内田和幸，猪熊 壽.;和田 啓
• 通讯作者: 和田 啓

Structural basis of the red-absorbing state of cyanobacteriochrome RcaE that regulates complementary chromatic acclimation in cyanobacteria

蓝藻色素RcaE的红色吸收状态的结构基础调节蓝藻互补色适应

• 发表时间: 2021
• 作者: Takayuki Nagae;Masashi Unno;Taiki Koizumi;Yohei Miyanoiri;Tomotsumi Fujisawa;Kento Masui;Takanari Kamo;Kei Wada;Toshihiko Eki;Yutaka Ito;Masaki Mishima;Yuu Hirose
• 通讯作者: Yuu Hirose

シアノバクテリアLeptolyngbya boryanaに由来する窒素固定遺伝子群の転写活性化タンパク質 CnfRが認識するDNA結合配列の探索

寻找 CnfR 识别的 DNA 结合序列，CnfR 是来自蓝藻 Leptolyngbya boryana 的固氮基因的转录激活蛋白

• 发表时间: 2020
• 作者: 和田 啓;元山 祐美子;綛田 紀子;梶 佳織;高尾 春奈;橋本 薫槻;辻本 良真;山本 治樹;藤田 祐一
• 通讯作者: 藤田 祐一

多成分酵素系SUFマシナリーによる鉄硫黄クラスターの生合成

使用多组分酶基 SUF 机械生物合成铁硫簇

• 发表时间: 2022
• 作者: 福田幸音;好井健太朗;苅和宏明;小林進太郎;前澤誠希，坂口加奈，互野佑香，藤井勇紀，赤上正貴，川上純子，渡邉謙一，古林与志安，小川晴子，猪熊 壽;松木 陽;平木慶人・西出旭・高木賢治・岩井一宏・Kim Minsoo・水島恒裕;和田 啓
• 通讯作者: 和田 啓