新規過剰発現ライブラリを用いた酵母のタンパク質分泌過程におけるボトルネックの解明

使用新型过表达文库阐明酵母蛋白分泌过程中的瓶颈

• 批准号: 20K05229
• 负责人: 伊藤 洋一郎
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K05229/
• 关键词: タンパク質分泌発現; 酵母; 過剰発現ライブラリ; ピキアパストリス; Pichia pastoris; スクリーニング

本研究では、独自に開発した過剰発現ライブラリを活用し、分泌生産性が異なる複数の外来タンパク質を用いて、それぞれの分泌生産に対して律速となっている因子をピキア酵母株より探索、比較することで、酵母の外来タンパク質分泌発現過程におけるボトルネックの解明を目指す。そのために、本年度では下記を行った。１．過剰発現ライブラリの質の評価：次世代シーケンサーを用いて、過剰発現ライブラリを、DNA断片レベル、プラスミドレベル、酵母ゲノムレベルにて評価した。外注で作製した一本鎖DNA配列に挿入・欠損変異が多くみられたものの、どのレベルにおいても過剰発現ライブラリとして機能することが確認できた。２．ピキア酵母株過剰発現ライブラリからのスクリーニング：人工的に設計されたscFv抗体の分泌発現株より、15個以上のscFv抗体分泌発現性が増加した株がスクリーニングにより得られた。それぞれの株の過剰発現した遺伝子を同定し、同遺伝子を過剰発現させたscFv分泌発現株を新たに作製した。そのscFv抗体生産性を評価した結果、10個以上の新規過剰発現型有用因子（過剰発現により外来タンパク質の分泌生産性を増加させるピキア酵母遺伝子）を得ることに成功した。この成功により、本過剰発現ライブラリが機能したことを実証できた。またピキア酵母にて難分泌生産性を示す外来タンパク質の生産株の過剰発現ライブラリを作製しスクリーニングを始めた。異なる外来タンパク質生産株においても、複数の過剰発現型有用因子が得られた。

This study で は, alone に 発 し た before turning 発 now ラ イ ブ ラ リ を use し, secrete the productive が different な る plural の foreign タ ン パ ク qualitative を with い て, そ れ ぞ れ の secretion production に し seaborne て law speed と な っ て い る factor を ピ キ ア yeast strains よ り exploration, compare す る こ と で, yeast の foreign タ ン パ ク qualitative secretion 発 now に お け る ボ ト ル ネ ッ ク Youdaoplaceholder0 explains that を refers to す. Youdaoplaceholder0 ために, で of the current year, the following line を った. 1. A turning 発 now ラ イ ブ ラ リ の qualitative の review 価 : nextgen シ ー ケ ン サ ー を with い て, turning 発 now ラ イ ブ ラ リ を, DNA fragment レ ベ ル, プ ラ ス ミ ド レ ベ ル, yeast ゲ ノ ム レ ベ ル に て review 価 し た. Outside the note で cropping し た lock a DNA match column に scions into, owe loss more than - different が く み ら れ た も の の, ど の レ ベ ル に お い て も before turning 発 now ラ イ ブ ラ リ と し て function す る こ と が confirm で き た. 2 ピ キ ア yeast strains before turning 発 now ラ イ ブ ラ リ か ら の ス ク リ ー ニ ン グ : artificial に design さ れ た scFv antibody secretion の 発 now strains よ り, over 15 の scFv antibody secretion 発 now sex が raised し た strains が ス ク リ ー ニ ン グ に よ り must ら れ た. そ れ ぞ れ の の strains through turning 発 now し た posthumous son 伝 を with し, with heritage 伝 son ever を turning 発 now さ せ た scFv secretion 発 now new strains を た に cropping し た. そ の scFv antibody production を review 価 し た results, more than 10 の new rules before turning 発 type is useful factor (turning 発 now に よ り foreign タ ン パ ク quality の secretion productive を raised plus さ せ る ピ キ ア yeast heritage 伝) を must る こ と に successful し た. The successful によ によ and the realization of the ラ ブラリが ブラリが ブラリが function of the bengochon <s:1> た とを とを practical evidence で た た. ま た ピ キ ア yeast に productive を て difficult secretion in す foreign タ ン パ ク qualitative の production plant の through turning 発 now ラ イ ブ ラ リ を cropping し ス ク リ ー ニ ン グ を beginning め た. The foreign なる タ パ パ パ of the producing strain of the germ にお て て なる and the multiple types of the present type of the useful factor が られた.