機能性乳酸菌を作出するための新規ゲノム改変技術の確立

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選択圧の無い環境下においても遺伝的形質を安定に保持し、薬剤耐性遺伝子に依存しない乳酸菌の遺伝子改変技術を確立することを目的として、ゲノム組み込み型ベクターの開発とゲノムに配座した薬剤耐性遺伝子を除去することが出来る in vivo excision システムの構築を行なう。L. casei ATCC27092に溶原化する PL-2 ファージ integrase 遺伝子とアタッチメントサイト(attP)からなる部位特異的組換え領域を用いて大腸菌ではプラスミド型、乳酸菌ではゲノム組み込み型として機能するシャトルベクターpAE0を構築し、その宿主として PL-2 ファージ溶原株である L.casei から PL-2 ファージを脱落させたキュアリング株 (C5株)を単離している。pAE0 にEPA 合成遺伝子を挿入してC5株を形質転換したところ、得られたC5EPA株は選択圧のない条件下 70 世代の培養後においても EPA 合成遺伝子を保持しており、HPLCによりEPAの産生が確認されている(未発表データ)。本年度はゲノム組み込み型で乳酸菌ゲノムに外来遺伝子と同時に配座するベクター由来の大腸菌の複製ユニット(Ori)とエリスロマイシン耐性遺伝子(EmR)を含めた不要領域(Ori-EmR)を除くin vivo excisionシステムを構築するために以下の実験を行った。1）D-リボース誘導性に溶菌酵素を発現するゲノム組み込み型のカウンターマーカーベクターpAEFRTGlysの作動条件の適正化と活性測定2）LDHプロモーター作動性に組み換え酵素FLPを発現するin vivo excision ヘルパープラスミドpHILCLFの作製と作動条件の適正化3）pAEFRTGlysをゲノムに保持する乳酸菌No.18株と41株にpHILCLFを導入した株のカウンターマーカー部分の切り出しの確認