環境ストレスに対するゲノム恒常性維持機構の解明

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ヌクレオソーム・ポジショニング配列として601配列を1コピー、その両側に5S rDNA配列を5コピーずつ導入したDNA基質を元に一本鎖環状DNAを調製し、損傷を含むオリゴヌクレオチドを601配列上にアニールさせる。これをプライマーとしてDNAポリメラーゼによる伸長反応、DNAリガーゼによる鎖連結反応を行うことで二本鎖環状DNA基質を作製し、塩化セシウムとエチジウムブロマイドを用いた密度勾配遠心法により分離・精製した。このDNA基質と精製ヒストンタンパク質、ヒストンシャペロンNAP-1を用いて試験管内でアレイの再構成を行った。また、塩化マグネシウムを用いてヌクレオソームを凝縮させ、遠心により沈殿させて上清を除くことでヌクレオソームのみを精製した。一方、ヌクレオソームに負の超らせんが蓄えられていることに着目しDNAの超らせん構造がNERに与える影響について調べるため、上記の方法で調製した二本鎖環状DNAをアガロースゲル電気泳動により精製し、超らせん構造を解消する酵素のE.coli Topoisomerase I (Topo I)と逆に超らせん構造を導入する酵素のDNA gyrase (gyrase) を用いて実験を行った。上記の方法で二本鎖環状としたDNAはリラックスした状態にあるため、まずそこにgyraseを反応させて超らせん構造を導入してから無細胞NER反応を行った。その結果、リラックスしている状態と比べて損傷の切り出し効率が上昇した。また、このとき無細胞NER反応では切り出しが確認できていなかった損傷であるCPDの切り出しも確認された。さらに超らせん構造を導入したDNA基質に対してTopo Iを反応させてから無細胞NER反応を行うと損傷の切り出し効率が低下したことから、負の超らせん構造が切り出し効率を上昇させていることが示唆された。