環境ストレスに対するゲノム恒常性維持機構の解明

阐明针对环境应激的基因组稳态维持机制

• 批准号: 19J10397
• 负责人: 多田 遥人
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-25 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19J10397/
• 关键词: ヌクレオチド除去修復; DNA損傷修復; DNA損傷認識; ヌクレオソーム構造; タンパク質精製; XPC

ヌクレオソーム・ポジショニング配列として601配列を1コピー、その両側に5S rDNA配列を5コピーずつ導入したDNA基質を元に一本鎖環状DNAを調製し、損傷を含むオリゴヌクレオチドを601配列上にアニールさせる。これをプライマーとしてDNAポリメラーゼによる伸長反応、DNAリガーゼによる鎖連結反応を行うことで二本鎖環状DNA基質を作製し、塩化セシウムとエチジウムブロマイドを用いた密度勾配遠心法により分離・精製した。このDNA基質と精製ヒストンタンパク質、ヒストンシャペロンNAP-1を用いて試験管内でアレイの再構成を行った。また、塩化マグネシウムを用いてヌクレオソームを凝縮させ、遠心により沈殿させて上清を除くことでヌクレオソームのみを精製した。一方、ヌクレオソームに負の超らせんが蓄えられていることに着目しDNAの超らせん構造がNERに与える影響について調べるため、上記の方法で調製した二本鎖環状DNAをアガロースゲル電気泳動により精製し、超らせん構造を解消する酵素のE.coli Topoisomerase I (Topo I)と逆に超らせん構造を導入する酵素のDNA gyrase (gyrase) を用いて実験を行った。上記の方法で二本鎖環状としたDNAはリラックスした状態にあるため、まずそこにgyraseを反応させて超らせん構造を導入してから無細胞NER反応を行った。その結果、リラックスしている状態と比べて損傷の切り出し効率が上昇した。また、このとき無細胞NER反応では切り出しが確認できていなかった損傷であるCPDの切り出しも確認された。さらに超らせん構造を導入したDNA基質に対してTopo Iを反応させてから無細胞NER反応を行うと損傷の切り出し効率が低下したことから、負の超らせん構造が切り出し効率を上昇させていることが示唆された。

ヌ ク レ オ ソ ー ム · ポ ジ シ ョ ニ ン グ match column と し て 601 match column 1 コ を ピ ー, そ の struck side に 5 s rDNA match column を コ ピ ー ず つ import し た DNA substrate を yuan に を し modulation, a lock circular DNA damage を containing む オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を 601 column deserve に ア ニ ー ル さ せ る. こ れ を プ ラ イ マ ー と し て DNA ポ リ メ ラ ー ゼ に よ る elongation 応, DNA リ ガ ー ゼ に よ る lock link against 応 を line う こ と で 2 lock circular DNA substrate を cropping し, salt セ シ ウ ム と エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ド を with い た density hook with far art に よ り separated, refined し た. こ の DNA substrate と refined ヒ ス ト ン タ ン パ ク qualitative, ヒ ス ト ン シ ャ ペ ロ ン を NAP - 1 with い て test tube で ア レ イ の to constitute を line っ た. ま た, salt マ グ ネ シ ウ ム を with い て ヌ ク レ オ ソ ー ム を condensation さ せ, telecentric に よ り Shen Dian さ せ て supernatant を except く こ と で ヌ ク レ オ ソ ー ム の み を refined し た. Side, ヌ ク レ オ ソ ー ム に negative の super ら せ ん が え storage ら れ て い る こ と に with mesh し DNA の super ら せ ん tectonic が NER に and え る influence に つ い て adjustable べ る た め, written の way で modulation し た 2 lock circular DNA を ア ガ ロ ー ス ゲ ル electric 気 swimming に よ り refined し, super ら せ ん tectonic を null す る enzyme の e.c. with our fabrication: oli Topoisomerase i. (Topo I) と inverse に super ら せ ん tectonic を import す の DNA gyrase る enzyme (gyrase) を い て be 験 を line っ た. Written の way で 2 lock ring と し た DNA は リ ラ ッ ク ス し た state に あ る た め, ま ず そ こ に gyrase を anti 応 さ せ て super ら せ ん tectonic を import し て か ら cell free NER the 応 を line っ た. そ の results, リ ラ ッ ク ス し て い る state と than べ て damage の り cutting out し sharper rate rising が し た. ま た, こ の と き cell free NER the 応 で は り cutting out し が confirm で き て い な か っ た damage で あ る CPD の り cutting out し も confirm さ れ た. さ ら に super ら せ ん tectonic を import し た DNA substrate に し seaborne て Topo I を anti 応 さ せ て か ら cell free NER the 応 を line う と damage の り cutting out し sharper rate low が し た こ と か ら, negative の ら せ ん tectonic が り cutting out し sharper rate rising を さ せ て い る こ と が in stopping さ れ た.

项目成果

The roles for ATPase activities of transcription factor IIH in nucleotide excision repair

转录因子 IIH ATPase 活性在核苷酸切除修复中的作用

• 发表时间: 2019
• 作者: Haruto Tada;Yuki Onishi;Shigenori Iwai;Kaoru Sugasawa
• 通讯作者: Kaoru Sugasawa

ヌクレオチド除去修復におけるTFIIHのATPアーゼの役割

TFIIH 的 ATP 酶在核苷酸切除修复中的作用

• 发表时间: 2019
• 作者: 多田 遥人;大西 優貴;岩井 成憲;菅澤 薫
• 通讯作者: 菅澤 薫

Differential requirements for the EF-hand domains of human centrin 2 in primary ciliogenesis and nucleotide excision repair

• DOI: 10.1242/jcs.228486
• 发表时间: 2019-10-01
• 期刊: JOURNAL OF CELL SCIENCE
• 影响因子: 4
• 作者: Khouj, Ebtissal M.;Prosser, Suzanna L.;Morrison, Ciaran G.
• 通讯作者: Morrison, Ciaran G.

National University of Ireland Galway(アイルランド)

爱尔兰国立大学戈尔韦（爱尔兰）

Processing of a single ribonucleotide embedded into DNA by human nucleotide excision repair and DNA polymerase η

通过人核苷酸切除修复和 DNA 聚合酶 η 处理嵌入 DNA 的单个核糖核苷酸

• DOI: 10.1038/s41598-019-50421-8
• 发表时间: 2019
• 期刊: Scientific Reports
• 影响因子: 4.6
• 作者: Sassa Akira;Tada Haruto;Takeishi Ayuna;Harada Kaho;Suzuki Megumi;Tsuda Masataka;Sasanuma Hiroyuki;Takeda Shunichi;Sugasawa Kaoru;Yasui Manabu;Honma Masamitsu;Ura Kiyoe
• 通讯作者: Ura Kiyoe