Elucidation of the molecular mechanism in transcriptional regulatory complex of human LRH-1 by X-ray crystallography and Cryo-EM

通过 X 射线晶体学和 Cryo-EM 阐明人 LRH-1 转录调控复合物的分子机制

• 批准号: 19K05706
• 负责人: 湯本 史明
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: High Energy Accelerator Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K05706/
• 关键词: 核内受容体; 転写因子複合体; X線結晶構造解析; クライオ電子顕微鏡; X線小角散乱解析; クライオ電子顕微鏡解析; LRH-1

Liver receptor Homologue-1（LRH-1もしくはNR5A2）は初期発生で重要な役割を担うばかりりでなく、肝臓、膵臓、卵巣においても遺伝子発現制御を担う核内受容体（Nuclear Hormone Receptor）の1つである。胚性幹細胞（ES細胞）においてOct3/4の発現制御も行っていることが示されていると共に、人工多能性幹細胞（iPS細胞）の誘導においてもOct3/4を代替しうる因子であることが示されるなど、幹細胞との関わりも深いタンパク質である。さらに、この転写因子はステロイドの代謝やコレステロール、胆汁酸のホメオスタシスにも関わるのみならず、乳癌、すい臓癌といった癌との関連も報告されている。このような背景から、LRH-1分子をターゲットにした低分子の薬剤候補化合物のスクリーニングが米国を中心に行われてきている。すなわち、基礎生物学としてのみならず、医学や薬学の観点からも注目されている分子である。このLRH-1はN末端からN末端ドメイン、DNA-binding domain（DBD）、天然変性領域からなるヒンジ領域、Ligand-binding domain（LBD）から構成されるが、このLRH-1分子については、LRH-1全長、DBD-ヒンジ-LBD、DBD単独、ヒンジ-LBD、LBDの発現・精製コンストラクトを作成し、特に全長分子がDNA2重鎖に結合した形での立体構造解析を試みてきた。これまでX線結晶構造解析のための結晶化に取り組んだが、結晶が得られなかったことから、X線結晶小角散乱解析を試みた。また、精製用タグ除去によるサンプル精製条件の最適化に取り組み、クライオ電子顕微鏡解析を試みたが、サンプルの自己会合が観察された。今後、単粒子解析を行うためにはさらに精製条件を最適化し、安定な条件を見出す必要があることがわかった。

肝受体同源1（LRH-1或NR5A2）不仅在早期发育中起重要作用，而且还是控制肝脏，胰腺和卵巢中基因表达的核受体之一。已经表明，OCT3/4的表达也受到胚胎干细胞（ES细胞）的调节，并且它是一种与干细胞密切相关的蛋白质，因为已证明它也是一个可用于诱导诱导的多能干细胞（IPS细胞）的因素。此外，这种转录因子不仅参与类固醇代谢，胆固醇和胆汁酸稳态，而且还据报道与癌症和胰腺癌等癌症有关。在这种背景下，主要在美国进行了针对LRH-1分子的小型药物候选化合物的筛选。换句话说，这是一个分子，不仅吸引了基本生物学的关注，而且还从医学和药房的角度引起了人们的注意。该LRH-1由N末端到N末端结构域，DNA结合结构域（DBD），一个由自然变性区域组成的铰链区域和配体结合域（LBD）组成。对于该LRH-1分子，我们为全长LRH-1，DBD-inghee-LBD，DBD，DBD，Hinge-LBD和LBD创建了表达和纯化构建体，并试图分析全长分子与DNA双重双重厚链结合的三维结构。到目前为止，我们一直致力于进行X射线晶体结构分析的结晶，但没有获得晶体，因此我们试图分析小角生角X射线晶体散射。此外，我们努力通过删除纯化标签，尝试的冷冻电子显微镜分析来优化样品纯化条件，并观察到样品的自我关联。已经发现，为了将来进行单个粒子分析，有必要进一步优化纯化条件并找到稳定的条件。