部位特異的遺伝子増幅機能を応用した放線菌二次代謝産物生産能力増強システムの構築

利用位点特异性基因扩增功能增强放线菌次生代谢产物生产能力的系统构建

基本信息

批准号：
19K05779
负责人：
小松護
金额：
$ 2.33万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

放線菌Streptomyces avermitilisのゲノム縮小株(SUKA)における、S. kanamyceticusならびにStreptomyces sp. RM04株由来のZouAの部位特異的遺伝子増幅機能を応用した二次代謝産物生産能力増強システムを構築した。zouA_kanをRsB-attBs-RsA-zouA_kanの並びでカセット化し、線状プラスミドSAP1に導入した。chloramphenicol(Cml)生合成遺伝子を含むpCML2をSAP1上のattBサイトに導入した。pCML2の選択マーカーであるapramycin耐性遺伝子を利用し、培地中のapramycin濃度を段階的に低濃度から高濃度に添加量を増やし、高濃度のapramycinに対して耐性を示す株を液体培養によって集積した結果、Cmlクラスターが増幅して巨大化したと推測されるSAP1が観察された。増幅されたpCML2を含むSAP1の存在比は極めて低かったが、Cmlの生産量はzouA非導入株の2倍程度(0.4g/L)まで増加した。一方で、zouA_RM04の場合では、pCML2をSAP1ベクター上への導入のみで、効率良くcmlが増幅された。更に効率の良い遺伝子増幅効果を期待して、Cumateを誘導基質とした誘導型プロモーター(Pcmt：P21-cmt-CymRシステム)を用いた結果、cumate添加の有無にかかわらず、効率の良いpCML2の増幅が確認された。RM04株由来の野生型プロモーターを利用した当初の結果と比較しても顕著な増幅効果が見られたことから、今後はPcmtを利用することによって、効率の良い遺伝子増幅が期待できる。また、パルスフィールド電気泳動の結果、増幅された遺伝子領域は欠失することなく安定的に保持されており、観察できる限り、11コピーまで増幅されていた。

我们已经构建了一个系统，用于使用Zoua的ZOUA和链霉菌链霉菌的ZOUA特异性基因扩增功能增强次级代谢产物。 RM04在基因组中降低的静脉细菌菌株（Suka）的应变。 Zoua_kan以序列RSB-ATTBS-RSA-ZOUA_KAN的序列进行了框架，并引入了线性质粒SAP1。将含有氯霉素（CML）生物合成基因的PCML2引入SAP1上的ATTB位置。使用APRAMYCIN耐药基因，PCML2的可选标记，培养基中的Apramycin浓度逐渐从低浓度增加到高浓度，而Apramycin浓度通过液体培养积累，导致SAP1，导致SAP1，该SAP1假定已扩增CML群集并变得较大。尽管含有放大PCML2的SAP1的丰度比极低，但CML的产生增加到了非ZOUA菌株的两倍（0.4 g/L）。另一方面，在ZOUA_RM04的情况下，CML通过简单地将PCML2引入SAP1矢量可以有效地放大。为了希望具有更有效的基因扩增效应，我们使用了诱导的启动子（PCMT：P21-CMT-CYMR系统），使用Cumate作为诱导底物，因此，无论是否添加了Cumate，都确认了PCML2的有效扩增。与使用从RM04菌株衍生的野生型启动子的原始结果相比，将来可以通过使用PCMT来期望有效的基因扩增。此外，由于脉冲场电泳的结果，放大的基因区域稳定保留而没有缺失，并尽可能将其放大至11份。