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部位特異的遺伝子増幅機能を応用した放線菌二次代謝産物生産能力増強システムの構築

利用位点特异性基因扩增功能增强放线菌次生代谢产物生产能力的系统构建

基本信息

批准号：
19K05779
负责人：
小松護
金额：
$ 2.33万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

放線菌Streptomyces avermitilisのゲノム縮小株(SUKA)における、S. kanamyceticusならびにStreptomyces sp. RM04株由来のZouAの部位特異的遺伝子増幅機能を応用した二次代謝産物生産能力増強システムを構築した。zouA_kanをRsB-attBs-RsA-zouA_kanの並びでカセット化し、線状プラスミドSAP1に導入した。chloramphenicol(Cml)生合成遺伝子を含むpCML2をSAP1上のattBサイトに導入した。pCML2の選択マーカーであるapramycin耐性遺伝子を利用し、培地中のapramycin濃度を段階的に低濃度から高濃度に添加量を増やし、高濃度のapramycinに対して耐性を示す株を液体培養によって集積した結果、Cmlクラスターが増幅して巨大化したと推測されるSAP1が観察された。増幅されたpCML2を含むSAP1の存在比は極めて低かったが、Cmlの生産量はzouA非導入株の2倍程度(0.4g/L)まで増加した。一方で、zouA_RM04の場合では、pCML2をSAP1ベクター上への導入のみで、効率良くcmlが増幅された。更に効率の良い遺伝子増幅効果を期待して、Cumateを誘導基質とした誘導型プロモーター(Pcmt：P21-cmt-CymRシステム)を用いた結果、cumate添加の有無にかかわらず、効率の良いpCML2の増幅が確認された。RM04株由来の野生型プロモーターを利用した当初の結果と比較しても顕著な増幅効果が見られたことから、今後はPcmtを利用することによって、効率の良い遺伝子増幅が期待できる。また、パルスフィールド電気泳動の結果、増幅された遺伝子領域は欠失することなく安定的に保持されており、観察できる限り、11コピーまで増幅されていた。

Streptomyces avermitilis ゲノム reduced strain (SUKA)における, S. kanamyceticusならびにStreptomyces sp. The RM04 strain is derived from the specific 伝 progeny amplifying function of the <s:1> ZouA b part を応, which is enhanced by the <s:1> た secondary metabolite production capacity システムを to construct <s:1> た. ZouA_kan を RsB - attBs - RsA - zouA_kan の and びでカセットし, linear プラスミド SAP1 に import した. The biosynthetic progeny of chloramphenicol(Cml) 伝 subsequon を containing むpCML2をSAP1 <s:1> attBサトにトに is introduced into たた. PCML2 の sentaku マーカーである apramycin patience heritage 伝 child を use し, petty の apramycin concentration を Duan Jie に low concentration から high-concentration にを amount raised やし, high concentration の apramycin にし seaborne て patience をすを strains in liquid culture によって set product した results, Cml クラスターが rights Amplitude: て magnification: たと speculation: されるSAP1が観 observe: された. Rights of された pCML2 を containing む SAP1 の existence than はめ extremely low てかったが, Cml の production は zouA not import strains の double degree (0.4 g/L) まで raised plus した. Party で, zouA_RM04 の occasions では, pCML2 を SAP1 ベクター on への import のみで, good working rate く CML が rights of された. More に good working rate のい heritage 伝 child rights of unseen fruit を expect して, Cumate を induced matrix とした induction type プロモーター (Pcmt: P21 - CMT - CymR システム) を with いた results, add の Cumate presence of にかかわらず, good working rate のい pCML2 の raised が picture confirm された. RM04 plant origin の wild-type プロモーターを using したの original results としても顕 the な raised sharper picture see fruit がられたことから, future は Pcmt を using することによって, good working rate のい heritage 伝 child rights of が expect できる. また, パルスフィールド気 swimming の results, rights of された heritage 伝 sub-fields は owe lost することなく stable に keep されており and examines 観できる limit り, 11 コピーまで rights of されていた.