世代を通した導入遺伝子の発現安定化を目指したDNAメチル化の人為的制御法の確立

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本研究では世代を越えると導入遺伝子の発現が抑制される“導入遺伝子サイレンシング”を回避する方法の確立を目指す。これら遺伝子サイレンシングの実体は導入遺伝子プロモーターの高DNAメチル化に起因すると考えられているため、導入遺伝子のサイレンシグにおけるDNAメチル化の関係を明らかにすることを目的とする。哺乳類では初期発生と生殖細胞形成過程において大規模なDNAメチル化の変動が起こることが報告されているが、メダカ配偶子形成におけるDNAメチル化の動体は未だ明らかでは無い。研究目的の達成のため、これまでにメダカ配偶子形成におけるDNAメチル化状態を明らかにした。具体的にはメダカ雌雄配偶子形成過程と初期発生におけるDNAメチル化パターンの変動をDNAメチル化の特異的である5メチルシトシン抗体を用いた免疫組織的手法と次世代シークエンサーによるDNAメチル化状態の網羅的解析から解析した。メダカ配偶子形成におけるDNAメチル化の機能を解析するため、DNAメチル化の修飾酵素であるDnmtファミリー遺伝子のノックアウト個体をCRISPR-Cas9システムにより作出した。メダカでは３種類のDnmt3遺伝子(Dnmt3a, Dnmt3b-1, Dnmt3b-2)が同定されており、これらすべてのノックアウト個体を作出した。今年度は3種類のDnmt3のうち2種や全てをノックアウトしたトリプルノックアウト個体のライン化並びに表現型解析を行った。