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偏光FRET法による細胞内アクチンのGF変換イメージング

使用偏振 FRET 方法对细胞内肌动蛋白进行 GF 转换成像

基本信息

批准号：
19K06593
负责人：
須河光弘
金额：
$ 2.75万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

近年のアクチン研究により作業仮説「細胞内の重合化アクチンは、様々なアクチン結合タンパクが結合解離するのに伴ってアクチン分子の構造が変化し（構造多形性）、その構造変化が近傍のアクチンに伝播して、特定のアクチン結合タンパクに対する親和性が局所的に変化している（アロステリック効果）」が生まれた。しかし、従来のセルイメージング法ではこの作業仮説を検証できない。そこで、開発課題「細胞内のアクチンの構造変化を１分子レベルでイメージングできるイメージング技術」が生まれた。この課題に対し、申請者が開発した偏光FRET法をライブセルイメージングに応用して、細胞内でのアクチンの局在、運動、配向そしてGF変換に伴う構造変化を計測することで、開発課題をクリアし、作業仮説を検証することを目指した。そこで、偏光FRET法を着想した。偏光FRET法は、FRETの理論に基づいて、偏光したドナーとアクセプターの相対角度の変化をFRETで捉える方法である。この方法であれば重合・脱重合に伴うアクチンの構造の「ねじれ」を検出することもできると期待された。蛍光を偏光させる方法は、αヘリックスにCys変異を２箇所導入し、SH 基反応性のbifucntional dyeを修飾するというものである。これまでの研究でCy5(Cy3)-bis-maleimideを合成し、これらの蛍光色素を修飾したアクチン（偏光FRETアクチン）を作成し、偏光FRETアクチンをHeLa細胞内にエレクトロポレーションで導入して、ライブセルイメージングを行うことに成功した。蛍光偏光の安定性など解決すべき課題が残っているものの一定の成果は得られたと考えている。

In recent years, the research on the interaction between proteins has been carried out, and it has been said that "the structural transformation of the molecules associated with the interaction between proteins in the cell (structural polymorphism), the structural transformation of the molecules associated with the interaction between proteins in the vicinity, and the structural transformation of the affinity between proteins associated with specific proteins" have been produced. This is the first time I've ever seen a job. The development topic of "Structural transformation of intracellular proteins" was developed. For this purpose, the applicant shall develop the polarization FRET method for the measurement of cellular structure, movement, orientation and transformation. For example, the polarized FRET method. The polarization FRET method is based on the theoretical basis of FRET, and the polarization of FRET is based on the theory of FRET. This method is called "coincidence" and "discoincidence". The method of light polarization is to introduce two different kinds of dye into the system, and to modify the bifunctional dye. In this study, Cy5 (Cy3)-bis-maleimide was synthesized, and the polarized FRET dye was successfully introduced into HeLa cells. The stability of polarized light can be solved by solving some problems.