分裂酵母収縮環のin vitro収縮系を用いたタンパク質の高分解能配向解析

点击翻译按钮获取中文摘要

細胞分裂は単細胞生物ではその増殖に、多細胞生物では発生、成長、個体の維持に必須の生命現象である。細胞分裂は核分裂と細胞質分裂の二つのステップからなり、動物細胞では、分裂面の細胞表層に形成されたアクチンとミオシンIIを主成分とする収縮環の収縮に伴って細胞膜がくびれ込み、細胞質分裂が起こる。収縮環が収縮するためには、筋肉の筋原線維（サルコメア）のように逆平行のアクチン繊維の束と、ミオシンIIの双極性複合体（繊維）が並んでいることが必要と考えられるが、いまだよくわかっていない。本研究は、分裂酵母の収縮環中のミオシンIIがどのように配向しているか、その配向が収縮環の成熟や収縮の進行に伴いどのように変化するかについて、超解像顕微鏡を用いたタンパク質配向解析法の確立を通して明らかにすることを目的としている。2022年度は、引き続き１）ミオシンII分子の配向解析法の確立、２）収縮環の成熟、収縮の進行に伴うミオシンII分子の配向の変化について調べるための実験材料の作製を進めた。これまではミオシンII重鎖の頭部（アミノ末端）と尾部（カルボキシル末端）にそれぞれ異なる蛍光タンパク質を融合したものを発現する分裂酵母株を用いていたが、自身のプロモーターで上記の融合タンパク質を発現する分裂酵母株を作製し、超解像観察を行ったところ、発現量が低く、蛍光タンパク質の明るさが不十分であった。そこで、蛍光タンパク質ではなく、蛍光標識リガンドと共有結合するHaloTagを融合したミオシンを発現する分裂酵母株を作製し、蛍光標識リガンドによるラベル条件を検討した。蛍光標識HaloTagリガンドにより収縮環に蛍光がみられ、ミオシンIIの局在を可視化することができた。しかし、HaloTag融合株において細胞の形態異常がみられたため、細胞質分裂への影響を詳細に解析している。