分裂酵母収縮環のin vitro収縮系を用いたタンパク質の高分解能配向解析

使用裂殖酵母收缩环体外收缩系统进行高分辨率蛋白质方向分析

• 批准号: 19K06661
• 负责人: 柏崎 隼
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K06661/
• 关键词: 収縮環; ミオシン; 分裂酵母; 細胞質分裂; 超解像顕微鏡

細胞分裂は単細胞生物ではその増殖に、多細胞生物では発生、成長、個体の維持に必須の生命現象である。細胞分裂は核分裂と細胞質分裂の二つのステップからなり、動物細胞では、分裂面の細胞表層に形成されたアクチンとミオシンIIを主成分とする収縮環の収縮に伴って細胞膜がくびれ込み、細胞質分裂が起こる。収縮環が収縮するためには、筋肉の筋原線維（サルコメア）のように逆平行のアクチン繊維の束と、ミオシンIIの双極性複合体（繊維）が並んでいることが必要と考えられるが、いまだよくわかっていない。本研究は、分裂酵母の収縮環中のミオシンIIがどのように配向しているか、その配向が収縮環の成熟や収縮の進行に伴いどのように変化するかについて、超解像顕微鏡を用いたタンパク質配向解析法の確立を通して明らかにすることを目的としている。2022年度は、引き続き１）ミオシンII分子の配向解析法の確立、２）収縮環の成熟、収縮の進行に伴うミオシンII分子の配向の変化について調べるための実験材料の作製を進めた。これまではミオシンII重鎖の頭部（アミノ末端）と尾部（カルボキシル末端）にそれぞれ異なる蛍光タンパク質を融合したものを発現する分裂酵母株を用いていたが、自身のプロモーターで上記の融合タンパク質を発現する分裂酵母株を作製し、超解像観察を行ったところ、発現量が低く、蛍光タンパク質の明るさが不十分であった。そこで、蛍光タンパク質ではなく、蛍光標識リガンドと共有結合するHaloTagを融合したミオシンを発現する分裂酵母株を作製し、蛍光標識リガンドによるラベル条件を検討した。蛍光標識HaloTagリガンドにより収縮環に蛍光がみられ、ミオシンIIの局在を可視化することができた。しかし、HaloTag融合株において細胞の形態異常がみられたため、細胞質分裂への影響を詳細に解析している。

Cell division is a vital phenomenon necessary for the development, growth, and maintenance of single and multicellular organisms. Cell division is the process of nuclear division and cytoplasmic division. Animal cell division is the process of cell surface layer formation. The main component of cell division is contraction of contraction ring accompanied by cell membrane contraction. Cytoplasmic division is initiated. The bipolar complex of the contraction ring and the tendon trace dimension of the contraction ring are parallel to each other, and the bipolar complex of the contraction ring and the tendon trace dimension of the contraction ring are parallel to each other. In this study, we established a new method for the determination of alignment in the cleavage and contraction rings of yeast by superresolution microscopy. In 2022, we introduced 1) the establishment of the alignment analysis method for the molecule of II, 2) the maturity of the ring and the progress of the alignment of the molecule of II, and the progress of the preparation of the material. The split yeast strain that has the head (end) and tail (end) of the double-lock of the double-lock of the double-lock The conditions for the production of split yeast strains from which HaloTag fusion occurs are discussed. Halotag is visible in the closed loop. The morphological abnormalities of HaloTag fusion strains and the effects of cytoplasmic division were analyzed in detail.