Structure-based analysis of the central itch receptors aiming at development of new medicine for chronic itch and cancer

基于结构的中枢瘙痒受体分析，旨在开发治疗慢性瘙痒和癌症的新药

• 批准号: 19K07358
• 负责人: 井上 明俊
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Kansai Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K07358/
• 关键词: 痒み; GRPR; 構造解析; クライオ電顕; 機能性抗体作製; がん; 結晶構造解析; 抗体医薬

本研究はGPCRファミリーである中枢痒み受容体GRPRのX線結晶解析やクライオ電顕を用いた構造解析を行い、痒み治療薬開発に重要な情報を得ることを目的とする。また、GRPRは肺がんや大腸がんなどの様々ながんにおいて過剰発現し、がん細胞の増殖や分化に関わる発がん因子でもある。そこで、本研究では構造解析の過程で作製するGRPRの立体構造認識抗体から阻害活性を持つものをスクリーニングし、がんの抗体医薬としての有用性を検証することを目的とする。一般的にGPCRは大部分が細胞膜に埋もれているうえに、活性型と不活性型の平衡状態で存在するため構造的にゆらぎが多く、大量変現が難しい。そこで、GRPRのC末端にGFPを結合させた融合タンパク質GRPR-GFPに様々な安定化変異を導入し、HEK293細胞に発現させ、蛍光検出機を備えたHPLCを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行いGRPR-GFPの発現量と安定性をGFPのピークを指標に解析した。GRPRは発現が不安定であり野生型のGRPR-GFPではほとんど発現のピークが確認できなかったが、N末、C末の欠損や点変異の導入、細胞内第3ループへの融合タンパク質bRILの導入を組み合わせることによりGRPRの構造的な安定化と高発現化に成功した。これにより、HEK293細胞を用いた大量培養系を用いてGRPRの安定化変異体（ｂRILあり、bRILなし）のタンパク質精製を行った。現在、GRPRの安定化変異体(bRIL導入あり)はbRIL抗体との複合体を作製し、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析を行っている。また、GRPRの安定化変異体(bRIL導入なし)はマウスに免疫しGRPRの機能性抗体の作製を行い、得られた抗体に関して結合能や阻害活性の評価を行っている。

The purpose of this study is to analyze the results of the GRPR X-ray of the central itching receptor. in this study, we need to analyze the GRPR X-ray of the central itching receptor. in this study, we analyzed the X-ray results of the central itching recipients. GRPR, lung cancer, lung cancer and lung cancer. The purpose of this study is to analyze the process of GRPR stereoscopic antibody production, antibody blocking activity, antibody therapy, and antibody usefulness. the purpose of this study is to determine the efficacy of antibody therapy. In general, most of the GPCR cells are buried in the cell membrane, and the balance of active and inactive cells exists in the balance state of the cells. The combination of GRPR and C-terminal GFP devices fuses the stability of GRPR-GFP devices into the system, the HEK293 cell detects the signal, and the light exporter uses the HPLC device to determine the quantity of GRPR-GFP, the quantity of GFP and the stability of the device. GRPR is unstable. Wild-type GRPR-GFP is not stable. It is confirmed that it is not stable. At the end of N and C, it is not stable. At the end of the cell, the fusion protein is fused. The bRIL is introduced into the tissue. The GRPR is stable and successful. Use the GRPR to stabilize the body (bRIL, bRIL), and use the GRPR to stabilize the cells. At present, the GRPR stabilized antibody (bRIL) and bRIL antibody complex are used as template, and the electron microanalyzer is used to analyze the particles. The anti-GRPR antibody (bRIL) was used to immunize the functional antibody of GRPR, and the combination of anti-tumor antibody and anti-tumor antibody could block the activity of antibody.