Structure-based analysis of the central itch receptors aiming at development of new medicine for chronic itch and cancer

本研究はGPCRファミリーである中枢痒み受容体GRPRのX線結晶解析やクライオ電顕を用いた構造解析を行い、痒み治療薬開発に重要な情報を得ることを目的とする。また、GRPRは肺がんや大腸がんなどの様々ながんにおいて過剰発現し、がん細胞の増殖や分化に関わる発がん因子でもある。そこで、本研究では構造解析の過程で作製するGRPRの立体構造認識抗体から阻害活性を持つものをスクリーニングし、がんの抗体医薬としての有用性を検証することを目的とする。一般的にGPCRは大部分が細胞膜に埋もれているうえに、活性型と不活性型の平衡状態で存在するため構造的にゆらぎが多く、大量変現が難しい。そこで、GRPRのC末端にGFPを結合させた融合タンパク質GRPR-GFPに様々な安定化変異を導入し、HEK293細胞に発現させ、蛍光検出機を備えたHPLCを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行いGRPR-GFPの発現量と安定性をGFPのピークを指標に解析した。GRPRは発現が不安定であり野生型のGRPR-GFPではほとんど発現のピークが確認できなかったが、N末、C末の欠損や点変異の導入、細胞内第3ループへの融合タンパク質bRILの導入を組み合わせることによりGRPRの構造的な安定化と高発現化に成功した。これにより、HEK293細胞を用いた大量培養系を用いてGRPRの安定化変異体（ｂRILあり、bRILなし）のタンパク質精製を行った。現在、GRPRの安定化変異体(bRIL導入あり)はbRIL抗体との複合体を作製し、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析を行っている。また、GRPRの安定化変異体(bRIL導入なし)はマウスに免疫しGRPRの機能性抗体の作製を行い、得られた抗体に関して結合能や阻害活性の評価を行っている。

本研究はGPCRファミリーである中枢痒み受容体GRPRのX線結晶解析やクライオ電顕を用いた構造解析を行い、痒み治療薬開発に重要な情報を得ることを目的とする。また、GRPRは肺がんや大腸がんなどの様々ながんにおいて過剰発現し、がん細胞の増殖や分化に関わる発がん因子でもある。そこで、本研究では構造解析の過程で作製するGRPRの立体構造認識抗体から阻害活性を持つものをスクリーニングし、がんの抗体医薬としての有用性を検証することを目的とする。一般的にGPCRは大部分が細胞膜に埋もれているうえに、活性型と不活性型の平衡状態で存在するため構造的にゆらぎが多く、大量変現が難しい。そこで、GRPRのC末端にGFPを結合させた融合タンパク質GRPR-GFPに様々な安定化変異を導入し、HEK293細胞に発現させ、蛍光検出機を備えたHPLCを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行いGRPR-GFPの発現量と安定性をGFPのピークを指標に解析した。GRPRは発現が不安定であり野生型のGRPR-GFPではほとんど発現のピークが確認できなかったが、N末、C末の欠損や点変異の導入、細胞内第3ループへの融合タンパク質bRILの導入を組み合わせることによりGRPRの構造的な安定化と高発現化に成功した。これにより、HEK293細胞を用いた大量培養系を用いてGRPRの安定化変異体（ｂRILあり、bRILなし）のタンパク質精製を行った。現在、GRPRの安定化変異体(bRIL導入あり)はbRIL抗体との複合体を作製し、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析を行っている。また、GRPRの安定化変異体(bRIL導入なし)はマウスに免疫しGRPRの機能性抗体の作製を行い、得られた抗体に関して結合能や阻害活性の評価を行っている。