Elucidation of pathogenic acquisition mechanism from the crystal structure of the collagen-binding proteins of Streptococcus mutans

Streptococcus mutansが産生するコラーゲン結合タンパク質Cnm/Cbmは約120kDaのタンパク質で、コラーゲン結合ドメイン（CBD）を介してコラーゲンに結合する。この結合メカニズムを解明するために、CBDを構成する4つのドメイン、N1、Linker、N2、Latchに着目し解析を進めてきた。これまでに4つのドメインを組み替えた変異体を作製し、CDによる熱安定性測定とELISAによるコラーゲン結合活性測定を行うことにより、これら4つのドメインの役割をそれぞれ、N1：コラーゲンとの結合に寄与する、Linker：N1、N2を補助しコラーゲン結合を支持する、N2：構造安定性、コラーゲンとの結合において中心的役割を担う、Latch：N2を補助し、N2と相互作用することでコラーゲン結合を支持する、と予想している。本年は、Cbm_CBDの4つのドメインの予想される機能と構造の相関を結晶構造学的に裏付けることを目的に、前年に引き続き、これまでに作製したCbm_CBDの各領域変異体の結晶化を継続実施した。一方、本研究では大腸菌を用いてCbm_CBDのWTおよび19変異体の計20種の目的タンパク質を発現しているが、その過程において、Cbm_CBDの可溶性発現量は100㎎/培地1Lにもなり、精製後の最終収量が非常に多いという点、および、コラーゲンとの結合についてはKD: 3.17 micro-M を示すことを明らかにしてきた。そこで、これらの特徴を利用したコラーゲンカラムとしての活用法を検討した。カラム担体へのコラーゲンとの結合が最適な条件を設定したのち、昨年度作製したGFP_Cbmを用い、コラーゲンカラムとしての有用性を検討した。

Streptococcus mutansが産生するコラーゲン結合タンパク質Cnm/Cbmは約120kDaのタンパク質で、コラーゲン結合ドメイン（CBD）を介してコラーゲンに結合する。この結合メカニズムを解明するために、CBDを構成する4つのドメイン、N1、Linker、N2、Latchに着目し解析を進めてきた。これまでに4つのドメインを組み替えた変異体を作製し、CDによる熱安定性測定とELISAによるコラーゲン結合活性測定を行うことにより、これら4つのドメインの役割をそれぞれ、N1：コラーゲンとの結合に寄与する、Linker：N1、N2を補助しコラーゲン結合を支持する、N2：構造安定性、コラーゲンとの結合において中心的役割を担う、Latch：N2を補助し、N2と相互作用することでコラーゲン結合を支持する、と予想している。本年は、Cbm_CBDの4つのドメインの予想される機能と構造の相関を結晶構造学的に裏付けることを目的に、前年に引き続き、これまでに作製したCbm_CBDの各領域変異体の結晶化を継続実施した。一方、本研究では大腸菌を用いてCbm_CBDのWTおよび19変異体の計20種の目的タンパク質を発現しているが、その過程において、Cbm_CBDの可溶性発現量は100㎎/培地1Lにもなり、精製後の最終収量が非常に多いという点、および、コラーゲンとの結合についてはKD: 3.17 micro-M を示すことを明らかにしてきた。そこで、これらの特徴を利用したコラーゲンカラムとしての活用法を検討した。カラム担体へのコラーゲンとの結合が最適な条件を設定したのち、昨年度作製したGFP_Cbmを用い、コラーゲンカラムとしての有用性を検討した。