Highly-sensitive molecular diagnosis using DNA-carrying nanoparticles with amplification reactions

使用携带 DNA 的纳米粒子和扩增反应进行高灵敏度分子诊断

• 批准号: 17F17343
• 负责人: 前田 瑞夫
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-11-10 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17F17343/
• 关键词: 核酸; 金ナノ粒子; 酵素反応; 比色分析; ニッキング酵素; キニーネ; アプタマー; 表面プラズモン共鳴

金ナノ粒子は分散状態では赤色を示すが、凝集すると表面プラズモン共鳴シフトにより青色になる。表面に短鎖DNAを密生させた金ナノ粒子は、DNAの鎖長や立体構造に応じて分散安定性が鋭敏に変化する。したがって、DNA修飾金ナノ粒子を切断、連結、重合などの酵素反応と組み合わせれば、さまざまな比色分析法に応用できる。本研究では、DNA修飾金ナノ粒子の酵素反応操作に基づくキニーネ比色分析法を構築した。キニーネはトニックウォーターなどの清涼飲料水に添加される苦味剤であるが、過剰摂取が神経毒症状を引き起こすことが報告されている。したがって、その量を簡便に検知する分析法の開発は重要である。本法は、ヘアピン型DNAアプタマープローブ、ニッキング酵素、およびニッキング酵素に認識・切断される配列をもつDNA修飾金ナノ粒子の３つで構築した。キニーネが試料溶液に含まれていると、ヘアピン型DNAアプタマープローブがキニーネに結合すると同時に直鎖状に開いて、粒子表面のDNAと二重鎖を形成する。この二重鎖のうち粒子表面に固定されたDNA鎖のみがニッキング酵素に切断され、ヘアピン型DNAアプタマープローブが粒子表面から遊離し、ほかの粒子の表面に結合して再利用される（信号増幅）。表面DNAが短縮されると粒子間の静電反発と立体反発が弱まるので、粒子は凝集して赤色から青色に変化する。これが本法の検出原理である。本年度はこの分析システムの概念実証実験に成功し、さらにキニーネ以外の物質（たとえばテトラサイクリンやクロラムフェニコール）には応答しないこと、米国食品医薬品局で認可されている上限量の１０分の１の量が目視検出できること、ヒト尿中に添加したキニーネも同様に目視検出できることを明らかにした。アプタマーの種類を変えることで、さまざまな標的物質の目視検出法に応用展開できると考えられる。

Gold particles are dispersed in red, aggregated in green, and resonant on the surface. The surface of the short chain DNA is closely linked to the gold particle, the DNA chain length, the three-dimensional structure, the dispersion stability, and the sensitivity. DNA modification of gold particles is used in enzyme reaction and colorimetric analysis. In this study, we constructed a colorimetric assay for the enzymatic reaction of DNA modified gold particles. The bitter taste of the cold drink was added to the water, and the toxic symptoms were reported. It is important to develop analytical methods that are simple and easy to measure. The method comprises the following steps of: recognizing, cutting and aligning DNA modification particles by using DNA modification enzymes; The sample solution contains DNA and DNA double locks on the particle surface. The double lock is immobilized on the particle surface, the DNA lock is cut off by enzyme, the DNA lock is dissociated from the particle surface, and the DNA lock is bound to the particle surface and reused (signal amplitude increase). Surface DNA is shortened, electrostatic and stereographic reactions between particles are weak, particles are aggregated, red and cyan are changed. This law is based on the principle of the law. This year, the concept of analysis system has been successfully demonstrated, and the US Food and Drug Administration has approved the maximum amount of 10 minutes of visual inspection for substances other than organic substances. A visual method for identifying the target substance is used.

项目成果

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