ＲＯＳ応答するラベル化分子の設計と条件付きプロテオミクスへの展開

响应ROS的标记分子的设计及其在条件蛋白质组学中的应用

基本信息

批准号：
17F17344
负责人：
浜地格
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-11-10 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17F17344/
关键词：
プロテオミクスタンパク質ラベリング

项目摘要

本研究では、多くの活性酸素（窒素）種の中でも過酸化水素に的を絞り、過酸化水素と選択的に反応し、反応活性が大幅に向上するようなconditional proteomicsのためのラベル化剤の分子設計を行った。過酸化水素応答ユニットに、イメージング／濃縮のための親和性タグ（フルオレセインなどの蛍光団）を繋いだ分子を合成し、これを用いて生細胞での過酸化水素応答挙動を評価した。その結果、細胞外から添加した過酸化水素に応答して細胞内タンパク質のラベル化が大きく加速されるだけでなく、細胞刺激によってROSを内在的に発生させた場合にもはっきりとしたラベル化の亢進が見られることをWestern blottingによって生化学的に確認した。従って、過酸化水素に応答して生細胞系でのプロテオミクスに利用できる初めての化学プローブの合成に成功したと言える。また、ラベル化はイメージングによっても明瞭に確認でき、特に固定化後もその蛍光画像が維持されるという特徴を有していた。さらに、これらの利点にMSMS解析を組み合わせて、内在性過酸化水素発生に伴うconditional proteomicsを実施し、マクロファージ細胞内で、過酸化水素が濃縮される小胞体ベシクルの実体解明に成功した。

在这项研究中，我们专注于许多活性氧（氮）物种的过氧化氢，并为条件蛋白质组学设计了标记剂的分子设计，该蛋白质组学与过氧化氢有选择地反应，从而显着改善了反应活性。将一个分子与附着在过氧化氢反应单元相连的亲和力标签（荧光团）中合成，以进行成像/富集，并用于评估活细胞中的过氧化氢反应行为。结果，我们通过蛋白质印迹通过生化证实，不仅在响应于从外部添加的过氧化氢中响应的细胞内蛋白的标记不仅是明显加速的细胞内蛋白，而且当ROS固有地通过细胞刺激产生时，观察到了明显的标记增加。因此，可以说，已成功合成了对过氧化氢的第一个化学探针，可用于活细胞系中的蛋白质组学。此外，可以通过成像清楚地确认标记，即使在固定后，荧光图像也尤其保持。此外，通过将这些优势与MSMS分析相结合，进行了与内源性氢产生相关的条件蛋白质组学，我们成功阐明了内质网囊泡的实际物质，其中过氧化氢浓缩在巨噬细胞中。