細胞内で高難度反応の触媒として働く人工金属酵素の創製

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本研究では、位置・立体選択的なC-H結合官能基化反応を促進する人工金属酵素の開発と細胞内反応への応用をめざしている。当該年度は人工金属酵素のタンパク質構造に着目し、人工補因子である鉄ポルフィセン錯体と種々のヘムタンパク質やその変異体と複合化し、C-H結合アミノ化反応の活性評価を実施した。まず、鉄ポルフィセン錯体と各種ヘムタンパク質のアポ体を複合化し、分子内C-H結合アミノ化反応に対する触媒活性を評価した。触媒回転数はタンパク質構造により変化し、シトクロムP450BM3 (BM3)と鉄ポルフィセン錯体を複合化した再構成シトクロムP450BM3 (rBM3)が高い触媒回転数を示した。次に、変異導入によるrBM3のタンパク質構造を改変し、高活性化を実施した。具体的には、補因子に配位しているシステインに着目し、19種類の一重変異体について、触媒反応を評価した。その結果、アスパラギン酸に置換した再構成体の変異体(rBM3*)が、rBM3に対して2倍高い触媒回転数を示した。次に、rBM3*の基質結合部位に存在する5つのアミノ酸残基に着目し、rBM3*一重変異体(95種類)とランダム変異導入により得られた多重変異体(約30種)を評価したところ、複数の変異体において、触媒回転数およびエナンチオ選択性が向上する結果を得た。さらに、より高活性な多重変異体の構築に向け、機械学習を使用した変異体の探索を実施した。得られた変異体データを初期データとし、(1)データを用いた機械学習モデルの構築、(2)機械学習による変異体ライブラリの設計、(3)実験による変異体の調製と触媒反応評価を実施した。得られる実験データを加えて、(1)-(3)のサイクルをさらに3回繰り返した。その結果、rBM3*に対して4倍高い触媒回転数を示す変異体の構築を達成した。上記の研究成果の一部は国内の学会にて発表し、高い評価を受けた。