ExVivoマイクロビオームモデル構築によるクローン病病因解明

通过构建 ExVivo 微生物组模型阐明克罗恩病的发病机制

• 批准号: 15K15189
• 负责人: 龍城 真衣子
• 金额: $ 2.41万
• 依托单位: Gunma University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-01 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15K15189/
• 关键词: 腸管上皮細胞; 末梢血単核球細胞; 共培養; 腸内細菌; CACO-2

クローン病は、遺伝因子、環境因子、腸内細菌叢、免疫異常、エピジェネティクス異常が複雑に絡み合って発症する原因不明の疾患である。本研究では、患者由来の末梢血単核球細胞と腸管上皮細胞株との共培養法に、さらに腸内細菌を添加するという、新しい実験系を確立することを目的とする。この実験系により、よりin Vivoに近い状態で、腸内細菌に対する患者免細胞の免疫反応を解析することを可能とし、クローン病の病因解明に迫ることを目的とする。方法は、（１）腸管上皮細胞モデルの作成、（２）腸管上皮細胞モデルの評価方法の確立、（３）炎症モデルの刺激による腸管細胞障害の評価とした。細胞株は、ヒト結腸癌由来株化細胞Caco-2は、RIKEN（継代数46）を使用し、0.4μmインサート上で14－21日間の長期培養を行った。播種するCaco-2細胞の濃度は、0.5×10*5/well、0.75×10*5/well、1.0×10*5/wellとした。インサートはHCL溶液で希釈したセルマトリックスタイプⅠ－Cにてコラーゲンコーティングを行った。腸管上皮モデルの評価方法は、形態学的評価、経上皮電気抵抗値の測定、LDH放出率の算出とした。複合培養による炎症モデルの刺激による腸管細胞障害の評価を行うため、新規発症のクローン病患者および基礎疾患のない対照群の血清、抽出した末梢血単核球細胞を保存した。今後、インサート内に播種した腸内細菌と免疫反応を起こした末梢血単核球細胞よりtotal RNAを精製し、マイクロアレイで発現解析を行う。また、培養液中に分泌されたサイトカインの解析や免疫反応前後の末梢血単核球細胞のポピュレーションをフローサイトメトリーによりタイピングし、免疫応答のカスケードについて検討していく。

克罗恩病是一种未知的疾病，它是由遗传因素，环境因素，肠道菌群，免疫疾病和表观遗传异常的复杂交织而发展的。这项研究旨在建立一个新的实验系统，其中将肠道细菌添加到患者衍生的外周血单核细胞和肠上皮细胞系的共培养方法中。该实验系统允许分析患者细胞在更接近体内的状态下肠道细菌的免疫反应，并旨在阐明克罗恩病的发病机理。这些方法是（1）创建肠上皮细胞模型，（2）建立用于肠上皮细胞模型的评估方法，以及（3）评估由刺激炎症模型引起的肠细胞损伤。该细胞系长期用于使用Riken（通道编号46）在0.4μm插入物上使用Riken（通道编号46）CACO-2培养14-21天。要接种的Caco-2细胞的浓度为0.5×10*5/井，0.75×10*5/孔，以及1.0×10*5/井。使用用HCL溶液稀释的I型细胞基质涂层胶原蛋白。肠上皮模型的评估方法是形态学评估，测量跨度电阻以及LDH释放速率的计算。通过复杂培养，血清和从新开发的克罗恩病患者和没有潜在疾病的对照组中提取的复杂培养，血清和提取的外周血单核细胞刺激炎症模型而导致的肠细胞损伤。总RNA是从外周血单核细胞中纯化的，这些细胞具有免疫反应，并在插入物中种植的肠道细菌，并使用微阵列进行表达分析。此外，我们将通过分析在流式细胞仪免疫反应之前和之后，通过分析在培养基中和周围血液单核细胞中分泌的细胞因子的级联反应。

项目成果

Differentiation of Crohn's disease from ulcerative colitis in children based on the serum cytokine profile.

根据血清细胞因子谱区分儿童克罗恩病和溃疡性结肠炎。

• 发表时间: 2016
• 作者: Tatsuki M;Ishige T;Hatori R,T omomasa T;Arakawa H
• 通讯作者: Arakawa H

血清サイトカインプロファイルによるクローン病と潰瘍性大腸炎の識別についての検討

通过血清细胞因子谱区分克罗恩病和溃疡性结肠炎

• 发表时间: 2016
• 作者: 龍城真衣子;羽鳥麗子、鍵本聖一、石毛 崇、五十嵐淑子、関根和彦、友政 剛、荒川浩一
• 通讯作者: 羽鳥麗子、鍵本聖一、石毛 崇、五十嵐淑子、関根和彦、友政 剛、荒川浩一