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第一減数分裂前期のR-loop形成制御に見る転写制御機構の雌雄差の解明

阐明第一次减数分裂前期 R 环形成调节转录控制机制中雄性和雌性的差异

基本信息

批准号：
21K15005
负责人：
藤原靖浩
金额：
$ 3万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15005/
关键词：
減数分裂 R-loop

项目摘要

本研究の主要目的の一つであるSETXの相互作用因子を探索するために、SETXをコードするSetx遺伝子のC末端にFLAGタグ及びHAタグを導入したノックイン（KI）マウス作成をゲノム編集技術を用いて試みた。挿入鋳型配列をもつssODNを複数用意し3度試みたが、完全な挿入配列をもつ個体を得ることが出来なかった。得られら不完全挿入配列を持つマウスの中から1bp欠損配列をもつKIマウスマウスと新たな鋳型配列ssODNを用いて配列の修正を試みたが、完全な配列をもつ個体を得ることは出来なかった。そこで、KIマウスの作出の代わりに、SETXに対する抗体を用いてSETX相互作用因子の同定を試みることとした。SETXのC末端を標的とするポリクローナル抗体を作成し、抗体の特異性を確認するために、WT細胞及びSetx欠損細胞を用いた免疫染色、SETX抗体を用いたCUT&Tagシーケンス及びChIP-seqを行った。その結果、SETX抗体は細胞内SETXを検出することができ、ChIP法にも利用可能であることが明らかとなった。また、CUT&Tagシーケンス及びChIP-seqの結果から、SETXはパキテン期精母細胞においてこの時期の転写において重要な機能を持つMYBL1をコードする遺伝子であるMybl1を含む数多くの遺伝子群のプロモーター領域に局在することが明らかとなり、SETXが直接標的とする遺伝子群を同定することに成功した。本年度は、SetxKO雄マウスの詳細な表現型解析、Setxによる減数分裂期の転写制御機構における解析、異なる発生段階の雄性生殖細胞を詳細に分画する手法開発、の三つの研究内容に関して研究代表者を筆頭著者として原著論文の執筆を進めた。

The main purpose of this study is to explore the interaction factors of SETX and to explore SETX's interaction factors.のC-terminal にFLAG タグ and びHA タグを import したノックイン (KI) マウスをゲノム editing technology いてtest みた. Insert the 鋳 type arrangement をもつssODNを plural intention し 3 degree trial みたが, insert the arrangement をもつ individual をget ることが come out なかった. Get the incomplete insertion arrangement of the をholding つマウスの中から1bp defective arrangement をもつKIマウスマウスと新たな鋳 type Alignment ssODN を Use いて alignment のcorrection みたが, complete arrangement をもつ individual をget ることは come out なかった.そこで, KIマウスの出の generation わりに, SETX に対するantibody をいてSETX interaction factor の同determination みることとした. SETX C-terminal を-targeted とするポリクローナル antibody preparation, antibody specificity confirmation するために, WT cells and びSe tx defective cells were immunostained using いた, SETX antibody was used いたCUT&Tagシーケンス and びChIP-seq was performed using いたCUT&Tag.その results, SETX antibodies and intracellular SETX を検出することができ, ChIP method is possible to use であることが明らかとなった.また、CUT&Tagシーケンス、びChIP-seqのRESULTSから、SETXはパキテン stage spermatocyte においてこのphase の転WRITE においてimportant なfunction をhold つMYBL1 をコードする伝子であるMybl1を怀多くの伝子群のプロモーター区にbureau in することが明らかとなり, SETXがdirectly bid on the とする伝subgroupを同定することにsuccessした. This year's は, SetxKO male マウスのdetailed phenotypic analysis, Setxによるmeiosis phase の転control mechanism における analysis, different なる発区The male germ cells of the order are detailed and drawn, and the technique is opened.