第一減数分裂前期のR-loop形成制御に見る転写制御機構の雌雄差の解明

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本研究の主要目的の一つであるSETXの相互作用因子を探索するために、SETXをコードするSetx遺伝子のC末端にFLAGタグ及びHAタグを導入したノックイン（KI）マウス作成をゲノム編集技術を用いて試みた。挿入鋳型配列をもつssODNを複数用意し3度試みたが、完全な挿入配列をもつ個体を得ることが出来なかった。得られら不完全挿入配列を持つマウスの中から1bp欠損配列をもつKIマウスマウスと新たな鋳型配列ssODNを用いて配列の修正を試みたが、完全な配列をもつ個体を得ることは出来なかった。そこで、KIマウスの作出の代わりに、SETXに対する抗体を用いてSETX相互作用因子の同定を試みることとした。SETXのC末端を標的とするポリクローナル抗体を作成し、抗体の特異性を確認するために、WT細胞及びSetx欠損細胞を用いた免疫染色、SETX抗体を用いたCUT&Tagシーケンス及びChIP-seqを行った。その結果、SETX抗体は細胞内SETXを検出することができ、ChIP法にも利用可能であることが明らかとなった。また、CUT&Tagシーケンス及びChIP-seqの結果から、SETXはパキテン期精母細胞においてこの時期の転写において重要な機能を持つMYBL1をコードする遺伝子であるMybl1を含む数多くの遺伝子群のプロモーター領域に局在することが明らかとなり、SETXが直接標的とする遺伝子群を同定することに成功した。本年度は、SetxKO雄マウスの詳細な表現型解析、Setxによる減数分裂期の転写制御機構における解析、異なる発生段階の雄性生殖細胞を詳細に分画する手法開発、の三つの研究内容に関して研究代表者を筆頭著者として原著論文の執筆を進めた。