Elucidation of Stim2 splicing mechanism and development of a novel therapeutic strategy of heart failure

阐明Stim2剪接机制并开发心力衰竭新治疗策略

基本信息

批准号：
21K15277
负责人：
伊藤淳平
金额：
$ 3万
依托单位：
National Cardiovascular Center Research Institute (2022)Osaka Medical and Pharmaceutical University (2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

心不全患者では心筋細胞内カルシウムイオン濃度が上昇していること、そして増加に伴い心機能の悪化を惹起しているためカルシウムイオン濃度を調節するタンパク質を標的とした創薬が心機能改善に有効である。本研究では、カルシウムイオンを貯蓄する小胞体のカルシウムイオンの枯渇により流入を引き起こすストア作動性カルシウム流入に着目し、その構成タンパク質であるSTIM2とそのスプライシング機構を調整することによりカルシウム流入を微調整できるような心不全治療薬の開発を目指す。今年度は、Stim2の選択的スプライシングに関与する因子の同定を試みた。心臓組織抽出液と5’末端をビオンチンで修飾した合成RNAを用いてRNAプルダウンアッセイを行い、結合したタンパク質を質量分析によって解析したところ、あるスプライシング調節因子が検出された。検出されたスプライシング調節分子をクローニングし、マウス筋芽細胞株C2C12に過剰発現させることでSTIM2.1/STIM2.2比の変化することを確認した。また、同様にC2C12細胞にスプライス調節分子を過剰発現させることでストア作動性カルシウム流入が変化することも確認した。さらに、本スプライシングが関与するexionやintronをクローニングしミニ遺伝子を作製し、バイオインフォマティクスツールにより複数予測されたRNA上の結合配列に変異を導入し、結合配列領域の同定を行った。その結果、本スプライシング調節因子の結合領域が同定された。

在心力衰竭的患者中，心脏内膜钙离子浓度升高，心脏功能的增加会导致心脏功能的恶化，因此，靶向调节钙离子浓度的靶向蛋白质有效改善心脏功能。这项研究的重点是储存的钙涌入，这导致由于内质网中钙离子的耗竭而导致钙离子的钙离子耗尽，后者存储钙离子，并旨在开发一种可以通过调节其组成蛋白刺激机制来调节钙涌入的心力衰竭的治疗剂，该剂可以通过调节钙涌入。今年，我们试图确定涉及STIM2替代剪接的因素。使用心脏组织提取物进行RNA下拉测定法，并用biontin在5'端修饰的合成RNA，并通过质谱法分析结合的蛋白质以检测某个剪接调节剂。将检测到的剪接调节分子克隆并过表达在小鼠成肌细胞细胞系C2C12中证实STIM22.1/stim2.2比率改变了。还证实，C2C12细胞中过度表达的剪接调节分子改变了储存钙钙的流入。此外，将其涉及的片段和介绍带有克隆来产生微型烯，并使用生物信息学工具将突变引入多个预测的RNA上的结合序列中，以识别结合序列区域。结果，确定了当前剪接调节剂的结合区域。