multi scale 3D structural analysis of SASRS-CoV-2 infected cells by electronmicroscopy

BSL3実験施設にてVero E6/ TMPRSS2細胞にSARS-CoV-2を感染させ、感染24時間でアルデヒドによる固定を行い、電子顕微鏡解析用の試料作製を行なった。30 nm, 120枚の超薄連続切片をアレイトモグラフィー法を用いて解析した。アレイトモグラフィーは連続切片を用いて解析を行うため、細胞全体の連続撮影を行ない、3次元的に感染細胞全体を観察し、その中で、興味深い視野について再度、倍率をあげて、撮影することが可能である。そこで、これまで詳細が明らかにされていない、新しく形成された子孫ウイルス粒子がどのように輸送され、細胞外へ出ていくか、その過程についての解析を試みた。感染細胞の広範囲を3次元で高分解能解析することにより、子孫ウイルス粒子がどこでどのように出芽し、どのような小胞で輸送されているのかを明らかにすることができた。さらに、ウイルス粒子が形質膜外へ放出される瞬間を捉えることに成功し、さまざまな形態でエクソサイトーシスすることで粒子が細胞外へ放出されることを明らかにした。その際に輸送小胞にの電子密度の高い膜構造が認められることがわかり、それについてさらに高分解能で解析するために、電子線トモグラフィーを行なった。再構築後、約0.6nmのスライス像を観察したところ、被覆ピットが付着していることを見出した。

BSL3実験施設にてVero E6/ TMPRSS2細胞にSARS-CoV-2を感染させ、感染24時間でアルデヒドによる固定を行い、電子顕微鏡解析用の試料作製を行なった。30 nm, 120枚の超薄連続切片をアレイトモグラフィー法を用いて解析した。アレイトモグラフィーは連続切片を用いて解析を行うため、細胞全体の連続撮影を行ない、3次元的に感染細胞全体を観察し、その中で、興味深い視野について再度、倍率をあげて、撮影することが可能である。そこで、これまで詳細が明らかにされていない、新しく形成された子孫ウイルス粒子がどのように輸送され、細胞外へ出ていくか、その過程についての解析を試みた。感染細胞の広範囲を3次元で高分解能解析することにより、子孫ウイルス粒子がどこでどのように出芽し、どのような小胞で輸送されているのかを明らかにすることができた。さらに、ウイルス粒子が形質膜外へ放出される瞬間を捉えることに成功し、さまざまな形態でエクソサイトーシスすることで粒子が細胞外へ放出されることを明らかにした。その際に輸送小胞にの電子密度の高い膜構造が認められることがわかり、それについてさらに高分解能で解析するために、電子線トモグラフィーを行なった。再構築後、約0.6nmのスライス像を観察したところ、被覆ピットが付着していることを見出した。