血小板減少症治療薬開発に向けたIL-6と受容体の複合体の三次元構造解析

IL-6 和受体复合物的三维结构分析用于开发血小板减少症疗法

• 批准号: 13218035
• 负责人: 佐藤 能雅
• 金额: $ 2.43万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13218035/
• 关键词: インターロイキン; IL-6; レセプター; X線結晶構造解析; 構造生物学; 受容体; 複合体; 三次元構造

ヒトのインターロイキン6(interleukin-6,IL-6)はとその受容体sIL-6Rと結合して細胞に作用する本研究では,IL-6と結合するsIL-6Rの2つのドメイン領域であるsIL-6Rbd単体,そしてIL-6とsIL-6Rの複合体の三次元構造をX線結晶構造解析によって解明することを目的としている。本研究によって三次元構造の知見が得られると,抗癌化学療法と放射線療法に伴う血小板減少症の治療薬の開発が大きく進展することになる。研究では,まず,これらの蛋白質の発現系と精製法を改良した。ヒトIL-6については,ゲノムDNAから大腸菌を用いる大量発現系を構築し,精製法も確立した。ヒトsIL-6R受容体の発現系では,sIL-6Rbdタンパク質が糖鎖を含むことから,メタノール資化酵母を用いた。発現量の向上と精製法の改善,エンドグリコシダーゼ酵素処理による糖鎖部位の均一な短鎖化を経て,結晶化用サンプルを調製した。調製したIL-6とsIL-6Rbdを混合して複合体形成を調べたところ,期待したとおりの安定な複合体が得られ。sIL-6Rbdについては束状に結晶粒が集合した多結晶が得られたが,X線の回折能はいまだ不十分であった。過剰産生されたIL-6がsIL-6Rと結合することによってリューマチ疾患は発症し,この結合を阻害する薬物は疾患の治療薬となる。そこで,単体よりはむしろ複合体のX線解析がこれらタンパク質分子の結合に関する構造知見を直接的に与えること,複合体の試料が大量に得られるようになったことから,両者をより大量に得て精製し,現在はその結晶化を進めている。結晶が得られるならば,結晶構造が既に報告されているIL-6をサーチモデルとする分子置換法を用いれば,直ちにX線解析が可能となることから,今後も複合体結晶の調製を精力的に展開させる計画である。

In this study, IL-6(interleukin-6,IL-6) binds to sIL-6R and plays an important role in the cellular function of sIL-6R. In this study,IL-6 binds to sIL-6R and sIL-6Rbd monomer, and the three-dimensional structure of IL-6 and sIL-6R complex is analyzed by X-ray crystallographic analysis. This study is aimed at understanding three-dimensional structures and developing new therapies for thrombocytopenia associated with anticancer chemotherapy and radiation therapy. In this paper, the protein production system and purification method were studied. IL-6 is the most important gene in the production of E. coli. sIL-6R receptor development system,sIL-6Rbd receptor development system The improvement of the production amount and purification method, the homogenization of the sugar lock site during the enzyme treatment, and the modulation of the crystallization temperature are also disclosed. IL-6 and sIL-6Rbd are mixed to form a stable complex. sIL-6Rbd is a bundle of crystalline particles, which are aggregated into multiple crystals, and X-ray reflection energy is not very high. IL-6 and sIL-6R are produced in the presence of a combination of drugs. X-ray analysis of the complex of the monomer and the structure of the complex are directly related to the binding of the molecule. The sample of the complex is obtained in large quantities, and the sample is refined in large quantities. Now the crystallization is progressing. Crystallization was obtained, crystal structure was reported, molecular replacement method was used, X-ray analysis was possible, and modulation energy of complex crystallization was developed in the future.

项目成果

R.Mizutani, S.Nogami, M.Kawasaki, Y.Ohya, Y.Anraku, Y.Satow: "Protein-splicing reaction via a thiazolidine intermediate : Crystal structure of the VMA1-derived endonuclease bearing the N and C-terminal propeptides"J.Mol.Biol.. (印刷中). (2002)

R.Mizutani、S.Nogami、M.Kawasaki、Y.Ohya、Y.Anraku、Y.Satow：“通过噻唑烷中间体进行蛋白质剪接反应：带有 N 和 C 末端前肽的 VMA1 衍生核酸内切酶的晶体结构“J.Mol.Biol..（印刷中）。（2002）

H.Yokoyama, R.Mizutani, Y.Satow, K.Sato, Y.Komatsu, E.Ohtsuka, O.Nikaido: "Crystal structure of DNA (6-4) photoproduct dTT(6-4)TT in complex with the 64M-2 antibody Fab fragment implies increased antibody-binding affinity by the flanking nucleotides"Acta

H.Yokoyama、R.Mizutani、Y.Satow、K.Sato、Y.Komatsu、E.Ohtsuka、O.Nikaido：“DNA (6-4) 光产物 dTT(6-4)TT 与

Ken Murase, Ryuta Mizutani, Yoshinori Satow: "Expression, characterization and crystallization of the Fv fragment of mouse antibody 3B62 from the secondary immune response"Acta Crystallographica. D57. 1703-1705 (2001)

Ken Murase、Ryuta Mizutani、Yoshinori Satow：“来自二次免疫反应的小鼠抗体 3B62 Fv 片段的表达、表征和结晶”《晶体学报》。