Elucidation of the pathogenesis of endoplasmic reticulum stress in congenital neutropenia based on proteome analysis

１年目においては、プロテオーム解析で示された結果の正確性について、先天性好中球減少症(CN)患者の好中球を用いて、実際にGSTP1の低下及び小胞体ストレス(UPR)亢進 が認められるか、immunoblotting法を用いて検証を行った。ELANE異常症、SRP54異常症、周期性好中球減少症のすべてのCN患者において、GSTP1の低下と、UPRの指標であるBipの上昇を認めた。またUPR以外の他のアポトーシス関連因子についても検討を行った結果、発現上昇を認めた。これらはプロテオーム解析で得られた結果と同等の結果であった。次に正常iPS細胞を用いてCRIPR/Cas9法によるGSTP1遺伝子の遺伝子破壊を施行し、CNにみられる好中球分化障害が認められるか検討を行ったが、分化障害はみられなかった。GSTP1の単独欠損のみでは好中球分化へ影響がないことが示されたため、さらなる分子学的病態について解析を行うため、ELANE異常症患者由来iPS細胞(CN-iPSC)において、ELANE遺伝子をCRIPR/Cas9法を用いて遺伝子破壊を行い(CN-iPSC-NE KO)、好中球分化障害に改善が得られるか検討したところ、分化障害の改善を認めた。２年目において、CN-iPSC、CN-iPSC-NE KO、正常iPSC由来好中球前駆細胞をsortし、RNA-seqを施行した結果、CN-iPSC、CN-iPSC-NE KOの間で主にanti-oxidant経路の遺伝子量のdysregulationが認められた。CNの病態にUPR関連(Bip, Chop, ATF4)のみならず、酸化ストレスが関わっていることが示唆された。

１年目においては、プロテオーム解析で示された結果の正確性について、先天性好中球減少症(CN)患者の好中球を用いて、実際にGSTP1の低下及び小胞体ストレス(UPR)亢進 が認められるか、immunoblotting法を用いて検証を行った。ELANE異常症、SRP54異常症、周期性好中球減少症のすべてのCN患者において、GSTP1の低下と、UPRの指標であるBipの上昇を認めた。またUPR以外の他のアポトーシス関連因子についても検討を行った結果、発現上昇を認めた。これらはプロテオーム解析で得られた結果と同等の結果であった。次に正常iPS細胞を用いてCRIPR/Cas9法によるGSTP1遺伝子の遺伝子破壊を施行し、CNにみられる好中球分化障害が認められるか検討を行ったが、分化障害はみられなかった。GSTP1の単独欠損のみでは好中球分化へ影響がないことが示されたため、さらなる分子学的病態について解析を行うため、ELANE異常症患者由来iPS細胞(CN-iPSC)において、ELANE遺伝子をCRIPR/Cas9法を用いて遺伝子破壊を行い(CN-iPSC-NE KO)、好中球分化障害に改善が得られるか検討したところ、分化障害の改善を認めた。２年目において、CN-iPSC、CN-iPSC-NE KO、正常iPSC由来好中球前駆細胞をsortし、RNA-seqを施行した結果、CN-iPSC、CN-iPSC-NE KOの間で主にanti-oxidant経路の遺伝子量のdysregulationが認められた。CNの病態にUPR関連(Bip, Chop, ATF4)のみならず、酸化ストレスが関わっていることが示唆された。