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疾患特異的iPS細胞を利用した先天性好中球減少の病態解明と新規治療薬探索

利用疾病特异性 iPS 细胞阐明先天性中性粒细胞减少症的病理学并寻找新的治疗药物

基本信息

批准号：
15K19618
负责人：
溝口洋子
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15K19618/
关键词：
先天性好中球減少症 iPS細胞

项目摘要

すでに樹立済みの健常人由来iPS細胞（WT-iPS）、先天性好中球球減少症由来iPS細胞(SCN-iPS、変異部位ELANE C194X)、周期性好中球減少症由来iPS細胞（CyN-iPS、変異部位ELANE R191Q）をマウス由来AGM-3S feeder細胞と共培養し、VEGF添加にて造血系に分化誘導させ、FACS AriaにてCD34陽性細胞に純化した。その後CD34陽性細胞を各種サイトカイン（SCF、IL-3、G-CSF、FLAT3、FP6）を用いてコロニーアッセイ及び液体培養にて顆粒球分化誘導を行った。コロニーアッセイでは14日目に評価を行い、SCN-iPSにおいてWT-iPS, Cy-iPSと比較し明らかに顆粒球マクロファージコロニーおよび顆粒球コロニー数の減少を認め、これは患者骨髄CD34陽性細胞を用いて行った同実験と同等の結果であった。また液体培養で得られた顆粒球は、培養7日目に評価を行い、形態学的に核の分葉を認め好中球様であった。フローサイトメトリーによる表面抗原解析を行い、顆粒球抗原であるCD13, CD33, CD11bの発現を確認した。細胞内MPO染色でも陽性を確認した。SCN-iPSにおいてはWT-iPS, Cy-iPSと比較し、細胞数の増加が乏しかった。また培養7日目に施行した形態学的所見において、WT-iPS, Cy-iPSでは成熟好中球を約半数以上に認めたが、SCN-iPSにおいては成熟好中球はわずかに認めるのみであり、死細胞を30%程度に認めた。培養10日目に行ったapoptosis assayにおいてはSCN-iPSではAnnexinV陽性細胞を約60%に認め、これはWT-iPS, Cy-iPSと比較し明らかに高値であった。SCN-iPS由来の好中球において細胞死の亢進を認め、これらは患者骨髄で認められた所見と同等であり、実証モデルとして使用可能であることを証明した。

We established iPS cells derived from healthy individuals (WT-iPS), iPS cells derived from congenital hypochondria (SCN-iPS, ELANE C194X), iPS cells derived from cyclic hypochondria (CyN-iPS, ELANE R191Q), co-culture of AGM-3S feeder cells, induction of hematopoietic differentiation by VEGF addition, and purification of CD34 positive cells by FACS Aria. CD34-positive cells were induced to differentiate into granulocytes by various media (SCF, IL-3, G-CSF, FLAT3, FP6) and liquid culture. The results of the comparison between SCN-iPS, WT-iPS and Cy-iPS showed that the number of granulocytes decreased, and the number of CD34 positive cells in bone marrow of patients decreased. In liquid culture, granulocytes were obtained. After 7 days of culture, the cells were evaluated. Morphological analysis showed that the nuclei were divided into leaves and spheres. Surface antigen analysis was performed, and the discovery of granulocyte antigens CD13, CD33, CD11b was confirmed. Intracellular MPO staining was confirmed. SCN-iPS is not suitable for WT-iPS, Cy-iPS, and the number of cells is increasing. More than half of the mature good spheres were identified by WT-iPS, Cy-iPS and SCN-iPS, and 30% of the mature good spheres were identified by dead cells. About 60% of AnnexinV positive cells were identified by SCN-iPS and Cy-iPS after 10 days of culture. SCN-iPS has been proven to be a good source of cell death.