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Elucidation of the mechanism of volume loss in long-term transplanted cartilage - Analysis using fluorescence imaging technique

阐明长期移植软骨体积损失的机制 - 使用荧光成像技术进行分析

基本信息

批准号：
21K16920
负责人：
力丸由起子
金额：
$ 2.16万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

皮下への軟骨移植後に軟骨量の減少と皮膚の菲薄化が起こる。先行研究では、移植床組織由来幹細胞から分化誘導された軟骨細胞が、移植軟骨の中に新生することを明らかにしたが、長期経過で軟骨量が減少する原因は未解明である。本研究では蛍光イメージング手法を用いて、軟骨減少の原因を解明することを目的とする。移植軟骨内/外の蛍光標識細胞の動態を可視化・定量解析し、(1)効率的に軟骨細胞に分化誘導される幹細胞の種類、(2)その最適付加量および(3)幹細胞の軟骨細胞誘導能が維持される期間の解明を行う。本研究によって術後の軟骨量の減少が起こりにくく、長期間組織量が保持される移植法の開発が可能になると考えている。 2021と2022年度は、蛍光標識した幹細胞群を生体内で可視化するモデルの作製(蛍光イメージング)をおこなった。この実験系では、脂肪由来幹細胞(ADSCs) に幹細胞標識用超低毒性色素(PKHリンカーキット)を用いて赤色蛍光標識した。蛍光標識反応は色素濃度に依存するために事前の調製の必要がある。また、蛍光色素の細胞膜標識の至適濃度を明らかにするために、SDラット皮下脂肪組織より単離された脂肪由来幹細胞を用いて、染色液の希釈系列を作製した。この実験系から脂肪幹細胞の蛍光イメージングに適用するPKHおよび核染色の至適濃度が明らかとなった。また、脂肪由来幹細胞の電子顕微鏡解析も合わせておこなったところ、細胞形態の異なる細胞群が存在する可能性が示唆された。幹細胞の超微形態についての情報が少なかったため、2022年度は移植前試料を用いて電子顕微鏡FIB/SEMおよびArray トモグラフィーを用いて形態解析を進めてきた。次年度は、移植モデルでの形態解析を進める予定である。

After subcutaneous cartilage transplantation, the amount of cartilage decreases and the skin becomes thinner. Previous studies have shown that stem cells, chondrocytes and cartilage regeneration in the graft bed tissue are the origin of stem cells, and the reasons for the decrease in cartilage volume after long-term treatment are not yet understood. The purpose of this study is to clarify the causes of cartilage reduction by using light and cartilage techniques. The dynamic visualization and quantitative analysis of cells labeled by fluorescence in and out of transplanted cartilage,(1) the types of stem cells induced by differentiation of chondrocytes at high efficiency,(2) the optimal amount of stem cells, and (3) the understanding of the duration of induction of soft bone cells by stem cells. This study aims to investigate the possibility of the development of the transplantation method, since the reduction of cartilage mass after operation and the maintenance of tissue mass over a long period of time In 2021 and 2022, the stem cell population was visualized in vivo. In this case, adipose-derived stem cells (ADSCs) are labeled with ultra-low toxicity pigment (PKH) and red light. Light identification depends on the pigment concentration, and prior modulation is necessary. The optimal concentration of fluorescent pigment in cell membrane is determined by the preparation of a series of staining solutions for subcutaneous adipose tissue derived stem cells. This is the optimal concentration of PKH and nuclear staining for adipose stem cells. Microscopic analysis of adipose-derived stem cells indicates the possibility of the existence of different cell populations. Stem cell ultra-morphology information, 2022 year before transplantation sample use FIB/SEM micro-microscope and Array use of morphological analysis The next year, the morphological analysis of the transplant was carried out.