RNAの酸化損傷ダイナミズムが制御するゼブラフィッシュ初期発生メカニズムの解明

阐明RNA氧化损伤动态控制的早期斑马鱼发育机制

• 批准号: 22K15042
• 负责人: 石橋 幸大
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Kyoto Sangyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15042/
• 关键词: ゼブラフィッシュ; 初期発生; RNA; 酸化ストレス; 胚発生

ゼブラフィッシュの初期発生過程において、活性酸素の一種である過酸化水素の細胞ないレベルと分布は発生段階や細胞群ごとにダイナミックに変化しており、これによって生じるRNAの酸化とトランスクリプトームの変化が密接にリンクしていると考えられる。まずは酸化損傷の生じたRNAを網羅的に同定するために、ゼブラフィッシュ胚からRNAを抽出したのち抗8-oxoG抗体を用いたRNA免疫沈降によって酸化損傷RNAを精製した。ポジティブコントロールとして、過酸化水素処理をしたゼブラフィッシュ胚からもRNAを抽出し同様の精製をおこなった。次世代シークエンスに供する前にRNAのクオリティコントロールをノザンブロッティングやRT-qPCRで行なったところ、酸化損傷に非特異的なRNAも大量に精製されていることが判明した。後の検討で、抽出したトータルRNAをそのまま免疫沈降に用いたことによるリボソームRNAのコンタミが問題であり、リボソームRNAの除去とRNAの断片化ののちに免疫沈降による精製をおこなう必要があると判明した。現在は改良したプロトコルによるRNAの精製と次世代シークエンスのライブラリ調整をおこなっている。次世代シークエンスが遅れており内在のmRNAを用いた評価はおこなえていないが、蛍光タンパク質をコードするレポーターmRNAに酸化損傷を施し、ゼブラフィッシュ胚へのインジェクション実験をおこなった。その結果、翻訳開始因子eIF2alphaのリン酸化に端を発する統合ストレス応答や、MAPキナーゼp38のリン酸化によるストレス応答が惹起されることがわかった。各々のタンパク質のリン酸化の程度は、mRNAの酸化損傷の程度に応じて大きくなることも見出した。

During the initial development of the cell, the distribution of one kind of active acid in the cell is divided into the development stage and the cell population is divided into two stages: the first stage and the second stage. In order to capture RNA from acidified lesions, anti-8-oxoG antibodies were used to extract RNA from embryos and to precipitate RNA immunologically to refine acidified damaged RNA. The process of RNA extraction and purification is carried out by acidification. The next generation of RNA was identified as a non-specific RNA gene. After the investigation, the extraction of RNA and the purification of RNA by immunosedimentation were identified. Now we have improved the RNA refinement and the next generation RNA refinement. The next generation of gene expression in the gene expression system was evaluated. The gene expression system was characterized by the presence of acid damage in the gene expression system. The gene expression system was characterized by the presence of acid damage. The results show that the inversion initiation factor eIF2alpha is the initial factor for the development of the MAPs, and the MAP is the initial factor for the development of the MAPs. The degree of acidification of each protein and the degree of acidification damage of mRNA are also discussed.