無細胞タンパク質合成を用いた定量リン酸化プロテオミクス法の構築

プロテオミクス分野における分析技術基盤の底上げを目的とし、独自のタンパク質絶対定量法であるMS-QBiC（Mass Spectrometry-based Quantification By isotope-labeled Cell-free products）法を改良する。MS-QBiC法とは、質量分析を用いた高感度タンパク質絶対定量法であり、定量内部標準の調製に再構成型無細胞翻訳系であるPURE systemを用いているため、高品質の安定同位体標識ペプチドの調製が簡便であり、費用対効果において極めて優れている。しかしながら、PURE systemは大腸菌の翻訳系を基盤としているため、MS-QBiC法で翻訳後修飾状態を定量的に解析することは現状困難である。そこで本研究では、翻訳後修飾のなかでも特に細胞内シグナル伝達系の活性調節に重要な役割を担うリン酸化状態の定量解析に有用な手法へと改良し、がん関連細胞内シグナル伝達系のプロファイリングに応用することを目的とする。当該年度では、古細菌の持つリン酸化セリン-tRNA合成系に着目し、それに関与する因子をPUREシステムに統合するため、先行研究を基に改変型のtRNA及びアミノアシルtRNA合成酵素の発現プラスミドを構築し、tRNAはT7 RNAポリメラーゼを用いてin vitro転写合成し、アミノアシルtRNA合成酵素は大腸菌組み換え発現系を用いて発現させた。

プロテオミクス分野における分析技術基盤の底上げを目的とし、独自のタンパク質絶対定量法であるMS-QBiC（Mass Spectrometry-based Quantification By isotope-labeled Cell-free products）法を改良する。MS-QBiC法とは、質量分析を用いた高感度タンパク質絶対定量法であり、定量内部標準の調製に再構成型無細胞翻訳系であるPURE systemを用いているため、高品質の安定同位体標識ペプチドの調製が簡便であり、費用対効果において極めて優れている。しかしながら、PURE systemは大腸菌の翻訳系を基盤としているため、MS-QBiC法で翻訳後修飾状態を定量的に解析することは現状困難である。そこで本研究では、翻訳後修飾のなかでも特に細胞内シグナル伝達系の活性調節に重要な役割を担うリン酸化状態の定量解析に有用な手法へと改良し、がん関連細胞内シグナル伝達系のプロファイリングに応用することを目的とする。当該年度では、古細菌の持つリン酸化セリン-tRNA合成系に着目し、それに関与する因子をPUREシステムに統合するため、先行研究を基に改変型のtRNA及びアミノアシルtRNA合成酵素の発現プラスミドを構築し、tRNAはT7 RNAポリメラーゼを用いてin vitro転写合成し、アミノアシルtRNA合成酵素は大腸菌組み換え発現系を用いて発現させた。