超微量タンパク質絶対定量法によるがん関連シグナル伝達系の包括的プロファイリング

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昨年度までに、多重定量可能に改良したMS-QBiC法を用いて微量且つ大規模な定量解析を行った。代表的なものとして、大腸菌リボソーム30Sサブユニットのストイキオメトリ解析、大腸がんマーカー探索、がん関連受容体型チロシンキナーゼの定量系確立などが挙げられる。一方で、がん関連因子のプロファイリングのためには、タンパク質の発現量の変動のみならず翻訳後修飾による制御を定量化する必要がある。特に、リン酸化はがん関連因子の活性制御に重要な役割を担っていることから、MS-QBiC法におけるリン酸化内部標準ペプチドの調製を目的に、大腸菌由来PUREシステムにリン酸化セリン(Sep)導入系を統合することを試みた。古細菌のSep-tRNA合成系を利用し、終止コドンUAGへの部位特異的Sep導入を行った先行研究に基づき、tRNA^Sep、Sep-tRNA^Sep合成酵素、Sep-tRNA^Sepを捕捉するEF-Tuをそれぞれ合成し単離した。次に、PUREシステム中でのSep導入効率を観察するために、緑色蛍光タンパク質（GFP）をモデル分子として、任意の1アミノ酸を終止コドンに置換した変異体鋳型DNAを複数種類設計した。そして、Sep、tRNA^Sep、Sep-tRNA^Sep合成酵素、EF-Tuを任意の量PUREシステムに添加した上で野生型GFPおよび各種変異体GFPを合成し、各蛍光強度をモニタリングした後、ペプチド断片化して質量分析によりGFP合成量およびSep導入効率を解析した。予想に反して、Sep導入因子群の添加によって野生型GFPの蛍光強度が低下し、Sep導入因子群によるタンパク質発現阻害が見られた。また、各種変異体においてもSepの導入は検出されなかった。そのため、各Sep導入因子の最適添加量を検討し、Sep導入率及び収量の向上を試みている。