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超微量タンパク質絶対定量法によるがん関連シグナル伝達系の包括的プロファイリング

使用超痕量蛋白质绝对定量对癌症相关信号转导系统进行全面分析

基本信息

批准号：
18J01791
负责人：
益田恵子
金额：
$ 2.33万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J01791/
关键词：
無細胞タンパク質合成質量分析絶対定量

项目摘要

昨年度までに、多重定量可能に改良したMS-QBiC法を用いて微量且つ大規模な定量解析を行った。代表的なものとして、大腸菌リボソーム30Sサブユニットのストイキオメトリ解析、大腸がんマーカー探索、がん関連受容体型チロシンキナーゼの定量系確立などが挙げられる。一方で、がん関連因子のプロファイリングのためには、タンパク質の発現量の変動のみならず翻訳後修飾による制御を定量化する必要がある。特に、リン酸化はがん関連因子の活性制御に重要な役割を担っていることから、MS-QBiC法におけるリン酸化内部標準ペプチドの調製を目的に、大腸菌由来PUREシステムにリン酸化セリン(Sep)導入系を統合することを試みた。古細菌のSep-tRNA合成系を利用し、終止コドンUAGへの部位特異的Sep導入を行った先行研究に基づき、tRNA^Sep、Sep-tRNA^Sep合成酵素、Sep-tRNA^Sepを捕捉するEF-Tuをそれぞれ合成し単離した。次に、PUREシステム中でのSep導入効率を観察するために、緑色蛍光タンパク質（GFP）をモデル分子として、任意の1アミノ酸を終止コドンに置換した変異体鋳型DNAを複数種類設計した。そして、Sep、tRNA^Sep、Sep-tRNA^Sep合成酵素、EF-Tuを任意の量PUREシステムに添加した上で野生型GFPおよび各種変異体GFPを合成し、各蛍光強度をモニタリングした後、ペプチド断片化して質量分析によりGFP合成量およびSep導入効率を解析した。予想に反して、Sep導入因子群の添加によって野生型GFPの蛍光強度が低下し、Sep導入因子群によるタンパク質発現阻害が見られた。また、各種変異体においてもSepの導入は検出されなかった。そのため、各Sep導入因子の最適添加量を検討し、Sep導入率及び収量の向上を試みている。

The improved MS-QBiC method was used for quantitative analysis of trace amounts and large amounts. The quantitative system of representative bacteria, Escherichia coli, Escherichia coli and Escherichia coli was established. The quantitative analysis of the correlation factors is necessary for the quantitative analysis of the variation of the quality of the correlation factors. The activity control of specific and specific factors plays an important role in the development of MS-QBiC method. The internal standard of acidification plays an important role in the development of Escherichia coli. Sep-tRNA synthesis in archaea was studied in advance by using, terminating, and site-specific Sep-introduction of DNA, tRNA, Sep-tRNA. In addition, Pure-type DNA is introduced into the genome in a variety of ways. In addition, wild-type GFP and various foreign GFP are synthesized at any amount of PURE, Sep, tRNA, Sep, Sep-tRNA, Sep synthetase, EF-Tu. In addition, the amount of GFP synthesized and Sep introduction rate are analyzed by mass analysis. In anticipation of this, the addition of Sep introduced factors reduced the fluorescence intensity of wild-type GFP and prevented the production of Sep introduced factors. All kinds of foreign languages are imported into China. The optimal addition amount of each Sep introduction factor is discussed, and the upward adjustment of Sep introduction rate and concentration is discussed.