GGCX活性評価とプロテオーム解析を用いた新規ワルファリン効果規定因子の探索

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ワルファリン（WF）の薬効予測のために多くの研究が実施されてきたが、効果規定因子の約40%は不明のままである。過去の研究ではPT-INRを用いて効果規定因子を探索しているため、未解明の個人差の要因がビタミンK（VK）サイクルから血液凝固のどの過程にあるのかが不明である。WFはγ-グルタミルカルボキシラーゼ（GGCX）の活性低下を介して薬効を示すため、本研究ではVKサイクル内の各因子によりGGCX活性を規定できるか、およびGGCX活性により凝固活性を規定できるかを分けて評価することで未解明の効果規定因子がどの過程にあるかを明らかにする。さらに個人差の過程に関連するタンパク質のプロテオミクスにより新規WF効果規定因子の検出を試みる。当該年度では「VKサイクル内の各因子によりGGCX活性を規定できるか」についての以下を実施した。1）VKサイクル内の因子とGGCX活性との相関の検討既知WF効果規定因子であるCYP2C9、CYP2C19、CYP4F2、VKORC1、GGCXの遺伝子変異をTaqman-Probe法を用いて解析した。また、ビタミンK（phylloquinone、menaquinone-4）およびWFの前処理方法の検討を実施し、高速液体クロマトグラフ―質量分析（LC-MS）法およびLC-UV法による測定系を確立した。さらに、GGCX活性を評価するため、VK依存性タンパク質（VKDP）の血液凝固因子のうち、半減期が長く血中濃度の高いプロトロンビンの特異的なペプチド配列6種を合成し、LC-MS法による測定系を確立した。2）GGCX活性とVK依存性タンパク質（VKDP）の凝固因子活性の相関の検討VKDPの血液凝固因子（第Ⅱ、第Ⅶ、第Ⅸ及び第Ⅹ因子）の凝固活性をシスメックス社の全自動血液凝固測定装置CA-600を用いて測定した。