膵癌エクソソームと癌関連線維芽細胞を介した薬剤耐性機序解明と診断法の確立

①膵癌におけるCD44v6+エクソソームに着目した薬剤耐性機序の解明まず、膵癌細胞株 Panc-1、Bxbc-3、Aspc-1、Capan-1を用いて、各細胞株におけるCD44v6およびCD44v6+エクソソーム発現量の解析を行った。その結果、Bxpc-3では細胞株およびエクソソームのどちらにおいてもCD44v6の発現量が高く、Panc-1では細胞株での発現量は高いものの、エクソソーム上には比較的少ないことが判明した。Aspc-1、Capan-1では細胞株、エクソソームのどちらにおいてもCD44v6の発現量が少ない結果であった。次に、Bxpc-3を用いて、CRISPER-Cas9法を用いたノックダウン細胞株の作成を行った。CD44v6の遺伝子配列に対するgRNA配列を持ったベクターを2種類作成し、コントロールプラスミドにはpx-459を用いた。リポフェクション法でトランスフェクションを行った後に、Puromycin selectionを行い、生き残り、プレート状で他の細胞と離れているsingle cellを選択的にピックアップしクローニングを行った。gRNA#2から作成したクローン細胞株に関しては、real time PCR法にて、コントロールと比較して優位にCD44v6の発現量が低下していることを確認した。現在、gRNA#1のクローン細胞株を作成中である。さらに、倫理委員会に膵癌手術検体の一部をサンプリングする申請を行い（研究番号33-460）、手術検体から針生検の要領で検体を採取し、培養して初代培養癌関連線維芽細胞(CAF)を得た。②治療奏功性を予測する薬剤耐性バイオマーカーの開発血清サンプル収集のため、がんセンター中央病院との共同研究を行う運びとなり、倫理委員会からの承認を得た（研究番号34-380）。

①膵癌におけるCD44v6+エクソソームに着目した薬剤耐性機序の解明まず、膵癌細胞株 Panc-1、Bxbc-3、Aspc-1、Capan-1を用いて、各細胞株におけるCD44v6およびCD44v6+エクソソーム発現量の解析を行った。その結果、Bxpc-3では細胞株およびエクソソームのどちらにおいてもCD44v6の発現量が高く、Panc-1では細胞株での発現量は高いものの、エクソソーム上には比較的少ないことが判明した。Aspc-1、Capan-1では細胞株、エクソソームのどちらにおいてもCD44v6の発現量が少ない結果であった。次に、Bxpc-3を用いて、CRISPER-Cas9法を用いたノックダウン細胞株の作成を行った。CD44v6の遺伝子配列に対するgRNA配列を持ったベクターを2種類作成し、コントロールプラスミドにはpx-459を用いた。リポフェクション法でトランスフェクションを行った後に、Puromycin selectionを行い、生き残り、プレート状で他の細胞と離れているsingle cellを選択的にピックアップしクローニングを行った。gRNA#2から作成したクローン細胞株に関しては、real time PCR法にて、コントロールと比較して優位にCD44v6の発現量が低下していることを確認した。現在、gRNA#1のクローン細胞株を作成中である。さらに、倫理委員会に膵癌手術検体の一部をサンプリングする申請を行い（研究番号33-460）、手術検体から針生検の要領で検体を採取し、培養して初代培養癌関連線維芽細胞(CAF)を得た。②治療奏功性を予測する薬剤耐性バイオマーカーの開発血清サンプル収集のため、がんセンター中央病院との共同研究を行う運びとなり、倫理委員会からの承認を得た（研究番号34-380）。