Development of novel therapeutics against ion transporters expressed in cancer-associated fibroblast

１，大腸癌切除14症例分の正常組織由来線維芽細胞（以下NF）ならびに癌組織由来線維芽細胞（以下CAF）をセットで分離培養に成功し、上皮系マーカー（EpCAM、サイトケラチン）がNFならびにCAFに存在しないことをタンパクレベルでウェスタンブロッティングを用いて確認した。それぞれのCAFマーカー（αSMA、FAP）のタンパク、RNAレベルをWB、RT-PCRにて確認し、CAF>NFと発現が亢進している細胞ペアを抽出した。さらにそのうち、Boyden chamber法にて上層にヒト大腸癌細胞株HCT116、下層に線維芽細胞を配置し遊走能の解析を行い、CAF>NFと遊走能が亢進している細胞ペアを抽出した。２，１で適格となった3症例分のNF、CAFペアからそれぞれmRNAを抽出してmRNAマイクロアレイ解析を行った。結果から有意にCAF>NFとmRNA発現亢進しているイオンチャネルや膜輸送体を選出した。３，２にて選出した候補をweb上のデータベースや過去の報告などより数個に絞りこみ、２のmRNAマイクロアレイ解析に使用したCAF、NFペアにてマイクロアレイ結果に対するバリデーションをRT-PCR法にて行った。さらにヒト線維芽細胞株を大腸癌細胞株と共培養すること（正常線維芽細胞株のCAF化）により前途のバリデーションを行い、分離培養細胞ペアを用いたマイクロアレイ解析と一致することを確認した。４，標的遺伝子のsiRNAを用い、分離培養したCAFにおいてノックダウンが問題なくできることをRT-PCR法にて確認した。

１，大腸癌切除14症例分の正常組織由来線維芽細胞（以下NF）ならびに癌組織由来線維芽細胞（以下CAF）をセットで分離培養に成功し、上皮系マーカー（EpCAM、サイトケラチン）がNFならびにCAFに存在しないことをタンパクレベルでウェスタンブロッティングを用いて確認した。それぞれのCAFマーカー（αSMA、FAP）のタンパク、RNAレベルをWB、RT-PCRにて確認し、CAF>NFと発現が亢進している細胞ペアを抽出した。さらにそのうち、Boyden chamber法にて上層にヒト大腸癌細胞株HCT116、下層に線維芽細胞を配置し遊走能の解析を行い、CAF>NFと遊走能が亢進している細胞ペアを抽出した。２，１で適格となった3症例分のNF、CAFペアからそれぞれmRNAを抽出してmRNAマイクロアレイ解析を行った。結果から有意にCAF>NFとmRNA発現亢進しているイオンチャネルや膜輸送体を選出した。３，２にて選出した候補をweb上のデータベースや過去の報告などより数個に絞りこみ、２のmRNAマイクロアレイ解析に使用したCAF、NFペアにてマイクロアレイ結果に対するバリデーションをRT-PCR法にて行った。さらにヒト線維芽細胞株を大腸癌細胞株と共培養すること（正常線維芽細胞株のCAF化）により前途のバリデーションを行い、分離培養細胞ペアを用いたマイクロアレイ解析と一致することを確認した。４，標的遺伝子のsiRNAを用い、分離培養したCAFにおいてノックダウンが問題なくできることをRT-PCR法にて確認した。