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固体NMRによる蛋白質の構造形成と機能発現における金属イオンの作用機構の解析

使用固态NMR分析金属离子在蛋白质结构形成和功能表达中的作用机制

基本信息

批准号：
09780610
负责人：
辻暁
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Himeji Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

高度好塩菌(Halobacterium salinarium)の細胞膜に局在する光プロトンポンプ蛋白質バクテリオロドプシン(bR)に結合する金属イオンの結合様式を固体高分解能^<13>CNMRを用いて解析した。紫膜からイオン交換樹脂によりイオンを除去すると、bRの吸収は短波長シフトし、固体NMRにより観測される蛋白質立体構造が大きく変化する。この変化は紫膜懸濁液のpHをl.2とした時の変化と一致しており、イオン除去による吸収波長、立体構造の変化は対イオン除去による紫膜の表面pH低下に由来することがわかった。少量のNaOHにより脱イオン膜懸濁液のpHを中性に調整すると、吸収波長は脱イオン処理前の紫膜に一致し、アラニン残基側鎖メチル炭素の固体NMRスペクトルも膜貫通部位では処理前の状態に戻った。このとき、紫膜中のbRに本来結合している二価金属イオンがNa^+に置換されることで蛋白質表面のループ部位に構造変化が誘起されたことを示すNMR信号のシフトが観測された。そこで、Na^+イオンをNMR緩和試薬であるMn^<2+>に置換することにより、二価金属イオン結合部位近傍のアラニン残基の信号を選択的に広幅化させ、bR中の金属イオン結合部位の特定を行った。その結果、二価金属イオン結合部位は主に細胞質側および細胞外側の親水表面に分布するループ部位に局在し、その一つの位置を膜貫通ヘリックスFのC-末端に露出した複数のペプチド主鎖のカルボニル酸素と特定することができた。また、Mn^<2+>添加量と信号広幅化の挙動より、bRと結合する二価金属イオンは蛋白質表面の金属イオン結合サイトおよび周囲の脂質の親水頭部の負電荷の間を容易に交換していることが明らかになり、金属イオン結合部位が蛋白質内部ではなく、親水表面に分布していることが強く示唆された。

The binding formula of metal in the cell membrane of Halobacterium salinarium was analyzed by <13>CNMR. The absorption of IR and NMR spectra at short wavelengths and the stereostructure of protein were studied. The pH of the purple membrane suspension is 1.2. The absorption wavelength and the stereoscopic structure of the purple membrane suspension are different. A small amount of NaOH is added to the pH of the membrane suspension. The absorption wavelength is adjusted to the pH of the membrane before the treatment. The absorption wavelength is adjusted to the pH of the membrane before the treatment. The structure of the protein surface is induced by the substitution of the two metals in the membrane. The signal of the residue near the binding site of the metal ion in the NMR spectrum was amplified and the specific binding site of the metal ion in the IR spectrum was determined. As a result, the two metal binding sites are distributed from the cytoplasmic side to the hydrophilic surface outside the cell, and the C-terminal of the membrane is exposed at a certain position. The amount of Mn^<2+> added to the signal amplitude of the two metal ions is easily exchanged between the metal ions on the protein surface and the negative charge on the hydrophilic head of the lipid.