固体高分解能^<13>CNMRによる^<13>C標識膜蛋白質の動的高次構造の解析

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1.低温におけるバクテリオロドプシンの動的高次構造:バクテリオロドプシンのアラニン残基の側鎖メチル炭素を^<13>C標識し、固体高分解能^<13>CNMRを用いて観測することにより、23℃から-110℃におけるバクテリオロドプシンの高次構造と運動状態の変化を観測することができた。これまでに帰属し、報告した二次構造依存化学シフト値をもとに、NMR信号の強度および化学シフト値の変化から観測された動的構造の変化を二次構造に対応づけて解析した。膜貫通部位およびループ部位のNMR信号は-40℃以下の低温で広幅化し、これらの部位が低温下で二面体角に分布のある構造に凍結されることを示した。これより、常温におけるバクテリオロドプシンの二次構造は二面体角の揺らぎを持つ動的な構造であることが明らかになった。また、温度に依存する二次構造の揺らぎの変化は試料が10mM NaClを含むイオン強度の高い緩衝液に懸濁された場合だけに観測され、イオン強度の低い緩衝液中では観測されないことから、蛋白質および脂質頭部に分布する電荷間の相互作用に由来する脂質間、蛋白質間および脂質-蛋白質間の相互作用が蛋白質の動的高次構造に強く影響していることが直接に観測できた。また、膜外に存在し、高い運動性を持つC末端部位のNMR信号は-20℃以下で消滅し、温度の低下により膜外部の運動性も低下することがわかった。2.部位特異的変異バクテリオロドプシンによるNMR信号の帰属:53位のアラニン残基をそれぞれグリシンおよびバリンに置換した部位特異的変異バクテリオロドプシン、A53VおよびA53Gを用い、53位アラニンの信号を帰属した。変異体におけるアラニン信号の減少から16.3ppmの信号が53位アラニンに帰属され、53位アラニンがα_<II>-ヘリックス構造をとることがわかった。