酵素センサータンパク質FixLのヘム・キナーゼ間情報伝達機構の解明

阐明酶传感器蛋白FixL的血红素激酶信号传递机制

• 批准号: 09780617
• 负责人: 田村 浩二
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780617/
• 关键词: 窒素固定; two-component system; 酵素センサー; 転写因子; NMR; 分子認識; two component system; 酸素センサー

FixL/Jは根粒菌に含まれるタンパク質で、窒素固定反応の制御に関与している。窒素固定反応は低酸素濃度の時のみ起こる。これは酸素センサータンパク質FixLが酸素濃度の減少を感知するとレギュレータータンパク質FixJがリン酸化され、窒素固定関連遺伝子fixK、nifAのプロモーター部分に結合するためである。このFixL/Jは、"two-component system"と呼ばれる細胞内情報伝達系の典型的な例である。酸素センサータンパク質FixLのヘム・キナーゼ間情報伝達は、最終的にFixJとDNAとの正確な結合という形で具現化される。本年度はそのメカニズムに迫るべく研究を行った。FixJのC末端側(FixJC)はDNA結合ドメインを構成しており、その立体構造をNMRを用いて解明した。この構造をもとに、DNA存在下でのNMR測定、蛍光偏光度測定などを行い、FixJのDNA結合に寄与するアミノ酸残基を特定し、結合メカニズムを明らかにすべく研究を進めた。DNA存在下、非存在下で^<15>NラベルされたFixJCの2次元^1H-^<15>NHSQCスペクトル測定を行い、アミドプロトンのクロスピークがシフトしたアミノ酸残基の同定を試みた結果、Ser44のシグナルに明らかな変化が認められた。次に蛍光物質(FITC)ラベルされたDNAとFixJの変異体を用いて蛍光偏光度測定を行った。Ser44の変異体は蛍光偏光度測定ではDNAとの結合に対する影響が見られなかったので、これが位置している4番目のαヘリックス(α4)上に存在する電荷を持つアミノ酸残基(Arg、Glu)に着目して変異体を調製した。その結果、DNAとの結合に関与しているという結果が得られた。Ser44は、DNA結合に関与するArg46と水素結合しているため、構造変化の際に影響を受け、NMR測定におけるクロスピークの変化をもたらしたと結論した。

FixL/J に rhizomyroides に contains まれるタ パ パ で, nitrogen-fixed anti応 に control に and て て る る る. When the concentration of nitrine is low, <s:1> み starts to <s:1> る. こ れ は acid element セ ン サ ー タ ン パ ク qualitative FixL が acid levels の reduce を perception す る と レ ギ ュ レ ー タ ー タ ン パ ク qualitative FixJ が リ ン acidification さ れ, smothering element fixed masato even heritage 伝 fixK, nifA の プ ロ モ ー タ ー part に combining す る た め で あ る. <s:1> <s:1> FixL/J, "two-component system"と hu ばれる intracellular information 伝 da is a typical な example である. Acid element セ ン サ ー タ ン パ ク qualitative FixL の ヘ ム · キ ナ ー ゼ between intelligence 伝 は, final に FixJ と DNA と の な right combination と い で う form with a modern さ れ る. This year, そ そ メカニズムに compels るべく to study を industries った. FixJ の C terminal side (FixJC) は dna-binding ド メ イ ン を constitute し て お り, そ の three-dimensional structure を NMR を with い て interpret し た. こ の tectonic を も と に, DNA in the presence of で の determination of NMR and 蛍 light polarization degree な ど を い, FixJ の dna-binding に send す る ア ミ ノ acid residues を し, combining with specific メ カ ニ ズ ム を Ming ら か に す べ を く research into め た. The presence of DNA, the presence of で ^ < 15 > N ラ ベ ル さ れ た FixJC の 2 yuan ^ 1 h - ^ < 15 > NHSQC ス ペ ク ト ル determination を い, ア ミ ド プ ロ ト ン の ク ロ ス ピ ー ク が シ フ ト し た ア ミ ノ acid residues の be を try み た results, Ser44 の シ グ ナ ル に Ming ら か な variations change が recognize め ら れ た. Subに 蛍 light matter (FITC)ラベ て蛍 されたDNAとFixJ <s:1> variants を are measured by the polarization of <s:1> て蛍 light を for った. Ser44 の - variant は 蛍 light polarization degree determination で は DNA と の combining に す seaborne る influence が see ら れ な か っ た の で, こ れ が position し て い る four times eye の alpha ヘ リ ッ ク ス (alpha 4) に exist on す る charge を hold つ ア ミ ノ acid residues (Arg, Glu) に mesh し て - variant を modulation し た. The そ そ result, the combination of DNAと <e:1> with に and the が て ると ると う う う が result が obtained られた. Ser44 は, DNA binding に masato and す る Arg46 と water element combination し て い る た め, structural variations の interstate に を by け, NMR measurement に お け る ク ロ ス ピ ー ク の variations change を も た ら し た と conclusion し た.

项目成果

Nakamura, H., Saito, K., Ito, E., Tamura, K., Tsuchiya, T., Nishigaki, K., Shiro, Y.and Iizuka, T.: "Identification of the hydrophobic amino acid residues required for heme assembly in the rhyzobial oxygen sensor protein FixL." Biochem.Biophys.Res.Commun.

Nakamura, H.、Saito, K.、Ito, E.、Tamura, K.、Tsuchiya, T.、Nishigaki, K.、Shiro, Y. 和 Iizuka, T.：“鉴定所需的疏水性氨基酸残基