新しい癌抑制遺伝子の単離

新抑癌基因的分离

基本信息

批准号：
09780657
负责人：
立石智
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

私はこれまでチャイニーズハムスター培養細胞を用いて、細胞周期のチェックポイント機構に異常を示す変異株を分離してきた。これらの変異株の原因遺伝子の構造と機能を知ることができれば、チェックポイント機構について重要な知見が得られると考え、変異株の原因遺伝子のジェノミックDNAクローニングを行った。ヒト由来のジェノミックDNAを変異株細胞に導入した後、低血清条件下でヌクレオチドアナログに耐性となった細胞(一次トランスフォーマント)を単離した。その細胞から全DNAを回収し、再び最初の変異株に導入し、ヌクレオチドアナログ耐性となった二次トランスフォーマントを単離した。二次トランスフォーマント由来の全DNAを用いてAlu-PCRを行い、ヒトゲノムDNAの一部を得た。そのDNAの配列を調べた結果、データベース上で既知のゲノム配列と1.1kbpほぼ完全に一致した。またこのDNAはほぼすべての一次、及び二次トランスフォーマントに存在していたことから、原因遺伝子を含むジェノミックDNAであると推定された。上記のDNA断片に対応するBACジェノミッククローンを3株単離した。得られたBACクローンを変異株に導入し、無血清条件でのヌクレオチド耐性を調べることにより、これらが原因遺伝子を含むジェノミッククローンであるかどうか調査している。また得られたゲノム配列を遺伝子予測プログラムを用いて、cDNA予測を行った結果、この配列の近傍に数kbの遺伝子が存在することが予測された。更にこの予測された遺伝子は新規の遺伝子であり、既知の癌抑制遺伝子と一部相同性を示し、cDNAとして実在することがわかった。現在、この遺伝子の全長をcDNAライブラリーからクローニングしている。またこの遺伝子は癌抑制遺伝子と一部相同性を示すことから、癌抑制遺伝子であるかどうかについても調査する方向である。

我以前曾使用中国仓鼠培养的细胞分离出在细胞周期检查点机制中表现出异常的突变体。如果我们能够了解这些突变菌株的致病基因的结构和功能，我们认为将获得有关检查点机制的重要知识，并且我们进行了突变菌株的致病基因的基因组DNA克隆。在将人类衍生的基因组DNA引入突变细胞中后，分离了在低血清条件下对核苷酸类似物的抗性细胞（一级转化体）。从细胞中收集总DNA并将其重新引入第一个突变体，并分离出对核苷酸类似物具有抗性的二次转化剂。使用来自次要转化体的所有DNA进行ALU-PCR，以获得人类基因组DNA的一部分。检查了DNA序列，并且几乎将其与数据库中已知的基因组序列完全匹配。此外，由于该DNA几乎存在于所有原发性和二级转化体中，因此估计它是含有病因基因的基因组DNA。分离了与上述DNA片段相对应的三个BAC基因组克隆。将所得的BAC克隆引入突变菌株中，并在无血清条件下研究了核苷酸耐药性，以确定这些是否是含有因果基因的基因组克隆。此外，使用基因预测程序进行cDNA预测以预测获得的基因组序列，并预测该序列附近有几个Kb基因。此外，该预测的基因是一种新型基因，部分与已知的肿瘤抑制基因同源，并被发现作为cDNA存在。该基因的全长目前是从cDNA库克隆的。此外，由于该基因与抑制癌症基因部分同源，因此我们还研究它是否是癌症抑制基因。