組換え頻度の高いジーンターゲッティング法の開発

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1.ジーンターゲッティングとは、細胞の相同的組換え能により、染色体上の特定遺伝子を標的として、外から導入した遺伝子断片と組換え、計画的に染色体遺伝子構造を改変する手法である。本研究の目的はジーンターゲッティングの効率を飛躍的に高める事である。方法は標的遺伝子の近傍を積極的に切断するような化学修飾オリゴヌクレオチドを合成し、それをターゲッティングベクターとともに標的細胞に導入することにより、遺伝子の相同組換え頻度を増幅することである。2.まず標的遺伝子として選んだマウスのHPRT遺伝子のエキソン8にneo遺伝子を挿入することによりターゲッティングベクターを調製した。次にエキソン8上流部と3重鎖DNA構造を形成するような部位をえらび、その領域をふくむオリゴヌクレオチドを合成した。さらにその5'末端に2価の鉄イオンが結合できるように化学修飾を行なうことにより化学修飾オリゴヌクレオチドを合成した。3.つぎに実際にそのオリゴヌクレオチドがHPRT遺伝子を特異的に結合し切断する活性をもつかどうか試験管内で調べた。3重鎖構造を形成する活性を調べる方法としてDNaseIフットプリンティング法を用いた。切断活性については、放射能で標識したHPRT-DNAを基質としてオリゴヌクレオチドと反応させ、その後ゲル電気泳動により解析している。in vivoへの適用が今後の課題である。通常の3重鎖DNA構造は生理的なpHでは解離してしまうと考えられているため、それを防ぐような化学修飾オリゴヌクレオチドの開発及びスクリーニングを現在おこなっている。