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Islet-3の眼胞・中脳後脳境界部形成における機能解析

Islet-3视泡/中脑-后脑边界形成的功能分析

基本信息

批准号：
09780692
负责人：
菊池裕
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research (1998)Keio University (1997)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780692/
关键词：
Zebrafish LIM Homeodomain Protein Islet-3 Eye development Two-Hybrid System

项目摘要

LIM/ホメオドメイン蛋白は、zinc-finger様構造をしたLIMドメインとホメオドメインという2つの特徴あるドメインを有している。LIM/ホメオドメイン蛋白のin vitroでの機能解析の結果、LIMドメインはホメオドメインのDNAへの結合能を阻害するという実験結果が得られている。そのため、LIM/ホメオドメイン蛋白が活性化する時は、別の共役因子が発現し、これがLIMドメインと結合することによって、LIMドメインのホメオドメインへの阻害効果が解除されるというモデルが提唱されている。私はこのモデルに従い、ゼブラフィッシュ胚の中枢神経系で眼と視蓋に特異的に発現しているIslet-3のLIMドメインのみを過剰発現させ、内因性Islet-3の細胞内の共役因子を吸収することにより、Islet-3の機能を特異的に阻害する実験を行なった。その結果、眼胞・中脳後脳境界部(小脳原基)が完全に形成されず、Islet-3は、眼胞・中脳後脳境界部の形成において直接・間接的に重要な役割を持つことが明らかになった。私は、眼胞・中脳後脳境界部の形成におけるIslet-3の機能を明確にすることを目的に、Islet-3のLIMドメインに特異的に結合する共役因子の探索を行った。蛋白質間相互作用を用いた遺伝子スクリーニング法としては酵母を用いたyeast two-hybrid法、または発現ファージライブラリーを用いたfar-westem法などが知られている。two-hybridsystemでは、酵母内のタンパクとIslet-3のLIMドメインが相互作用してしまうことから、この系でのスクリーニングは困難であることが明らかとなった。far-westernは、Islet-3のLIMドメインとGSTとの融合蛋白をプローブとして用い、ゼブラフィッシュ22〜26時間胚発現cDNAライブラリー120万クローンに対してスクリーニングを行った。その結果、Islet-3のLIMドメインと特異的に相互作用する核タンパクとしてLANP(Leucine rich Acidic Neuclear Protein)が得られた。この核タンパクは、ラットに於いて生後小脳プルキンエ細胞で発現し、小脳の発生・回路形成などが進むにつれて発現が上昇することが報告されている。現在、中脳後脳境界部の形成におけるIslet-3・LANP複合体の役割を明らかにするため、解析を行っている段階である。さらに私は、Islet-3のLIMドメインを過剰発現させた胚では眼胞が全く形成されないことから、この胚における眼胞の形成に関わる遺伝子の発現をin situ hybridizationにより調べた。その結果、ホメオドメインを持つ転写制御因子であるRx,Six3の発現が、眼胞予定領域に於いて特異的に減少していることが明らかになった。現在、眼胞へ運命転換できなかった細胞の挙動について、発生段階ごとに観察を行っている。

LIM/ The results of functional analysis of LIM protein in vitro and the inhibition of DNA binding energy of LIM protein in vitro were obtained. When LIM/LIM is activated, different co-operating factors appear, and the inhibition effect of LIM/LIM is removed. Islet-3 has a special function in the central nervous system, such as the absorption of endogenous Islet-3 intracellular cofactors, the inhibition of Islet-3 function, and the development of Islet-3 LIM. As a result, the eye cell, middle and rear boundary (small primitive) are completely formed, Islet-3 is formed, and the eye cell, middle and rear boundary is formed directly and indirectly. To explore the interaction factors of Islet-3 in the formation of the boundary between Islet-3 and LIM. Protein-protein interactions are detected using the yeast two-hybrid method and the far-stem method. The two-hybrid system is designed to interact with each other in the culture medium. far-western, Islet-3 LIM and GST fusion proteins were developed from 22 to 26 hours of embryo development, and cDNA was generated from 1.2 million copies of fusion proteins. As a result, the specific interaction between Islet-3 and LIM was obtained. The nucleus is generated in small cells after birth, and the small cells are generated in circuits. Now, after the formation of the boundary part of the Islet-3·LANP complex, the separation of the work, the analysis of the middle stage The LIM of Islet-3 was developed in situ hybridization, which is related to the formation of the whole cell. As a result, the control factor is maintained and the occurrence of Six3 is reduced in the specific field of the eye cell. Now, the eye cell destiny changes, the cell movement changes, the development stage changes, the observation changes.