Islet-3の眼胞・中脳後脳境界部形成における機能解析

Islet-3视泡/中脑-后脑边界形成的功能分析

• 批准号: 09780692
• 负责人: 菊池 裕
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research (1998)Keio University (1997)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780692/
• 关键词: Zebrafish; LIM; Homeodomain Protein; Islet-3; Eye development; Two-Hybrid System

LIM/ホメオドメイン蛋白は、zinc-finger様構造をしたLIMドメインとホメオドメインという2つの特徴あるドメインを有している。LIM/ホメオドメイン蛋白のin vitroでの機能解析の結果、LIMドメインはホメオドメインのDNAへの結合能を阻害するという実験結果が得られている。そのため、LIM/ホメオドメイン蛋白が活性化する時は、別の共役因子が発現し、これがLIMドメインと結合することによって、LIMドメインのホメオドメインへの阻害効果が解除されるというモデルが提唱されている。私はこのモデルに従い、ゼブラフィッシュ胚の中枢神経系で眼と視蓋に特異的に発現しているIslet-3のLIMドメインのみを過剰発現させ、内因性Islet-3の細胞内の共役因子を吸収することにより、Islet-3の機能を特異的に阻害する実験を行なった。その結果、眼胞・中脳後脳境界部(小脳原基)が完全に形成されず、Islet-3は、眼胞・中脳後脳境界部の形成において直接・間接的に重要な役割を持つことが明らかになった。私は、眼胞・中脳後脳境界部の形成におけるIslet-3の機能を明確にすることを目的に、Islet-3のLIMドメインに特異的に結合する共役因子の探索を行った。蛋白質間相互作用を用いた遺伝子スクリーニング法としては酵母を用いたyeast two-hybrid法、または発現ファージライブラリーを用いたfar-westem法などが知られている。two-hybridsystemでは、酵母内のタンパクとIslet-3のLIMドメインが相互作用してしまうことから、この系でのスクリーニングは困難であることが明らかとなった。far-westernは、Islet-3のLIMドメインとGSTとの融合蛋白をプローブとして用い、ゼブラフィッシュ22〜26時間胚発現cDNAライブラリー120万クローンに対してスクリーニングを行った。その結果、Islet-3のLIMドメインと特異的に相互作用する核タンパクとしてLANP(Leucine rich Acidic Neuclear Protein)が得られた。この核タンパクは、ラットに於いて生後小脳プルキンエ細胞で発現し、小脳の発生・回路形成などが進むにつれて発現が上昇することが報告されている。現在、中脳後脳境界部の形成におけるIslet-3・LANP複合体の役割を明らかにするため、解析を行っている段階である。さらに私は、Islet-3のLIMドメインを過剰発現させた胚では眼胞が全く形成されないことから、この胚における眼胞の形成に関わる遺伝子の発現をin situ hybridizationにより調べた。その結果、ホメオドメインを持つ転写制御因子であるRx,Six3の発現が、眼胞予定領域に於いて特異的に減少していることが明らかになった。現在、眼胞へ運命転換できなかった細胞の挙動について、発生段階ごとに観察を行っている。

LIM / ホ メ オ ド メ イ ン protein は, any zinc finger others in tectonic を し た LIM ド メ イ ン と ホ メ オ ド メ イ ン と い う 2 つ の, 徴 あ る ド メ イ ン を have し て い る. LIM / ホ メ オ ド メ イ の ン protein in vitro で の functional analytic の results, LIM ド メ イ ン は ホ メ オ ド メ イ ン の DNA へ の binding energy を resistance against す る と い う be the result of 験 が ら れ て い る. そ の た め, LIM / ホ メ オ ド メ イ ン protein が activeness す る は, don't の total service factor が 発 し, こ れ が LIM ド メ イ ン と combining す る こ と に よ っ て, LIM ド メ イ ン の ホ メ オ ド メ イ ン へ の resistance against unseen fruit が remove さ れ る と い う モ デ ル が mention sing さ れ て い る. Private は こ の モ デ ル に 従 い, ゼ ブ ラ フ ィ ッ シ ュ embryo の central god 経 department で eye と inspect lid に specific に 発 now し て い る itouch - 3 の LIM ド メ イ ン の み を before turning 発 now さ せ, endogenous itouch の total service - 3 の cell factor を 収 absorption す る こ と に よ り, itouch - 3 の functional を specific に resistance against す る be 験 を line Youdaoplaceholder0. そ の results, eyes in the cell, after 脳 脳 state department (small 脳 primordium) が に form completely さ れ ず, itouch - 3 は, eye cell, after 脳 脳 state department の forming に お い て directly, indirectly に cut を hold important な service つ こ と が Ming ら か に な っ た. Private は, eye cell, after 脳 脳 state department の forming に お け る itouch - 3 の function を clear に す る こ と を purpose に, itouch - 3 の LIM ド メ イ ン に specific に combining す る factor の explore を total service line っ た. Traces of protein interaction between を with い た 伝 son ス ク リ ー ニ ン グ method と し て は yeast を with い た yeast two hybrid method, ま た は 発 now フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リ ー を with い た far - method of westem な ど が know ら れ て い る. Within two - hybridsystem で は, yeast の タ ン パ ク と itouch - 3 の LIM ド メ イ ン が interaction し て し ま う こ と か ら, こ の is で の ス ク リ ー ニ ン グ は difficult で あ る こ と が Ming ら か と な っ た. Far - western は, itouch - 3 の LIM ド メ イ ン と GST と の fusion protein を プ ロ ー ブ と し て い, ゼ ブ ラ フ ィ ッ シ ュ embryo 発 22 ~ 26 time cDNA ラ イ ブ ラ リ ー 1.2 million ク ロ ー ン に し seaborne て ス ク リ ー ニ ン グ を line っ た. そ の results, itouch - 3 の LIM ド メ イ ン と specific に interaction す る nuclear タ ン パ ク と し て LANP (Leucine rich Acidic Neuclear Protein) が must ら れ た. こ の nuclear タ ン パ ク は, ラ ッ ト に in い て born after small 脳 プ ル キ ン エ cells で 発 し now, little 脳 の 発 raw, loop forming な ど が into む に つ れ て 発 now rising が す る こ と が report さ れ て い る. Now, after 脳 脳 state department の forming に お け る itouch - 3 · LANP complex の "を cut Ming ら か に す る た め, analytical を っ て い る Duan Jie で あ る. さ ら に private は, itouch - 3 の LIM ド メ イ ン を before turning 発 now さ せ た embryo で は eye cell が く form all さ れ な い こ と か ら, こ の embryo に お け る eye cell の form に masato わ る heritage 伝 son の 発 を now in situ hybridization に よ り adjustable べ た. そ の results, ホ メ オ ド メ イ ン を hold つ planning write suppression factor で あ る Rx, Six3 の 発 に が, eye cell to set field in い て specific に reduce し て い る こ と が Ming ら か に な っ た. Now, eye cell へ luck planning in で き な か っ た cells の 挙 dynamic に つ い て, 発 Duan Jie ご と に 観 examine を line っ て い る.

项目成果

Yutaka Kikuchi et al.: "Ocular and cerebellar defects in zebrafish induced by overexpression of the LIM domains of the Islet-3 LIM/homeodomain protein." Neuron. Vol.18. 369-382 (1997)

Yutaka Kikuchi 等人：“Islet-3 LIM/同源域蛋白的 LIM 结构域过度表达诱导斑马鱼的眼部和小脑缺陷。”

Kikuchi,Y,Segawa,H,Tokumoto,M,Tsubokawa,T,Hotta,Y,Uyemur,K,and Okamoto,H.: "Ocular and cerebellar defects in zebrafish induced by overexpression of the LIM domain of the Islet-3 LIM/homeodomain protein." Neuron. 18. 369-382 (1997)

Kikuchi,Y,Sekawa,H,Tokumoto,M,Tsubokawa,T,Hotta,Y,Uyemur,K,and Okamoto,H.：“Islet-3 LIM 的 LIM 结构域过度表达诱导斑马鱼的眼睛和小脑缺陷

Kikuchi,Y,Segawa,H,Tokumoto,M,Tsubokawa,T,Hotta,Y,Uyemura,K,and Okamoto,H.: "Functional analysis of Islet-3 LIM/homeodomain protein in zebrafish brain development.in Molecular Basis of Axon Growth and Nerve Pattern Formation." Japan Scientific Societies P

Kikuchi,Y,Sekawa,H,Tokumoto,M,Tsubokawa,T,Hotta,Y,Uyemura,K,and Okamoto,H.：“斑马鱼大脑发育中 Islet-3 LIM/同源域蛋白的功能分析。在分子基础中