Botrytis cinereaの病原性に関与するβ−グルコシダーゼ

β-葡萄糖苷酶参与灰葡萄孢的致病性

• 批准号: 10760063
• 负责人: 佐々木 いづみ
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Oyama National College of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10760063/
• 关键词: Botrytis cinerea; β-グルコシダーゼ

(1) m-RNAの調製:Botrytis cinerea 7186株から総RNAをAcid Guanidinium-Phenol-Chloroform法により抽出した。Proteinase K処理によりRNaseを失活させた後、オリゴ(dt)セルロースカラムによりポリ(A)セレクションを行った。オリゴ(dt)セルロースカラム吸着画分よりm-RNAを得ることが出来た。(2) プライマーの調製:精製β-グルコシダーゼを用い、N末端は手動エドマン法、C末端はカルボキシペプチダーゼ法により各末端から8残基のアミノ酸の配列を決定した。このアミノ酸配列から塩基配列を推定し、それぞれ20〜24塩基対の長さのプライマーをデザインした。(3) cDNAの調製:Reverse transcription-PCR法(RT-PCR)により、cDNAの合成と増幅を行った。Reverseの反応はオリゴ(dt)プライマー,PCRは(2)で調製したプライマーを用いた。(4) cDNAライブラリーの作成:TAクローニングキットでcDNAライブラリーの作成を試みた。(5) 5'/3'RACE法でのcDNAの調製:RT-PCR法ではcDNAライブラリーを作成出来なかったので、このcDNAの調製を5'/3'RACE法で行い、TAクローニングキットでcDNAライブラリーの作成を試みた。その結果cDNAライブラリーの作成に成功した。(5) スクリーニング:本菌のβ-グルコシダーゼはX-gluで活性染色できるので、(4)のホワイトコロニーをレプリカ法でX-gIu添加培地にレプリカし、ブルーコロニーを選択した。その結果、10株のポジティブクローンを得ることが出来た。以上のことによりBotrytis cinereaのcDNAライブラリィーの作成とβ-グルコシダーゼのクローニングを行うことが出来た。

(1) m-RNA <s:1> modulation: を RNAをAcid guanidinum-phenol-chloroform method によ によ extraction た from Botrytis cinerea 7186 strain. Proteinase K 処 Richard に よ り RNase を inactivation さ せ た, オ リ ゴ (dt) セ ル ロ ー ス カ ラ ム に よ り ポ リ (A) セ レ ク シ ョ ン を line っ た. オ リ ゴ (dt) セ ル ロ ー ス カ ラ ム sorption draw points よ り を m - RNA to る こ と が た. (2) プ ラ イ マ ー の modulation: refined beta グ ル コ シ ダ ー ゼ を い, N terminal は manual エ ド マ ン method, C terminal は カ ル ボ キ シ ペ プ チ ダ ー ゼ method に よ り each end か ら 8 residues の ア ミ ノ acid の match column を decided し た. こ の ア ミ ノ acid with column か ら salt base with column を presumption し, そ れ ぞ れ 20 ~ 24 salt base の seaborne long さ の プ ラ イ マ ー を デ ザ イ ン し た. (3) cDNA fission modulation :Reverse transcription-PCR (RT-PCR)によ と, cDNA fission synthesis と amplitude-を line った. Reverse <s:1> reverse 応 リゴ リゴ リゴ(dt)プラ プラ た 応,PCR リゴ(2)で modulation たプラ たプラ を を を を using を た. (4) cDNA ラ イ ブ ラ リ ー の is made: TA ク ロ ー ニ ン グ キ ッ ト で cDNA ラ イ ブ ラ リ ー の done try を み た. (5) 5 '/ 3' RACE method で の cDNA の modulation: rt-pcr method で は cDNA ラ イ ブ ラ リ ー を made out な か っ た の で, こ の cDNA の modulation を 5 '/ 3 RACE line で い, TA ク ロ ー ニ ン グ キ ッ ト で cDNA ラ イ ブ ラ リ ー の made を try み た. Youdaoplaceholder0 <s:1> result cDNAラ に ブラリ ブラリ そ た た に に successful た た. (5) ス ク リ ー ニ ン グ : this bacterium の beta グ ル コ シ ダ ー ゼ は X-ray glu で reactive dyeing で き る の で, (4) の ホ ワ イ ト コ ロ ニ ー を レ プ リ で X-ray gIu カ method to add the petty に レ プ リ カ し, ブ ル ー コ ロ ニ ー を sentaku し た. The そ そ result, 10 plants ポジティブ ポジティブ ロ ロ ロ を を を を る とが とが とが た come out た. Above の こ と に よ り Botrytis cinerea の cDNA ラ イ ブ ラ リ ィ ー の made と beta グ ル コ シ ダ ー ゼ の ク ロ ー ニ ン グ を line う こ と が た.