RasおよびRaplaによるRaf-1およびB-Rafの調節機構

Ras和Rapla对Raf-1和B-Raf的调控机制

• 批准号: 10770050
• 负责人: 岡田 知代
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10770050/
• 关键词: Ras; Rap1A; Raf-1; B-Raf; Cysteine-rich domain

癌遺伝子産物Rasがそのeffettor分子であるRafを活性化する際、2種類の結合が必要である。第一の結合はRasのeffector領域と、Raf-1のRas-Binding Domain(RBD)との結合であり、第二の結合はRasのactivater領域と、RafのCysteine-Rich Domain(CRD)を介するものである。Rap1AはRasと同一のeffector領域を有しRBDと結合するが、Raf-1を活性化できず、むしろRasによるRaf-1活性化を阻害する。しかしB-Rafは活性化することができる。我々はRap1AがCRDと非常に強く結合し、このためRaf-1の活性を抑制することを見出しており、本研究では、Rap1AおよびRasと、RafのCRDとの結合親和力の程度によりRafの活性化と活性化阻害が調節されているとの仮説を立て、昨年度までに、Raf-1とB-Rafの各ドメインを交換した種々のキメラ変異体、特にCRDを入れ替えたキメラ変異体を作成し、その活性を測定した結果、B-RafのCRDを持ったRaf-1はRap1Aにより活性化され、逆にRaf-1のCRDを持ったB-RafはRap1Aにより活性化されなくなるという結果を得ている。さらにRaf-1およびB-RafのCRDにランダムに変異を導入したプールを作成し、その中からRasに対する結合は野生型と同様であるが、Rap1Aに対する結合が増強しているB-RafのCRDの変異体、K252E/M278Tを見出した。この変異体のRasおよびRap1Aによる活性を測定したところ、Rasによる活性は有するが、Rap1Aによる活性は消失していた。本年度はさらにRaf-1CRDとB-RafCRDの、RasおよびRap1Aに対する結合親和性を、32PラベルしたGTP_γSを用いることにより、定量的に測定し比較した。この結果、Rap1AのB-RafCRDに対する結合は、Raf-1CRDに比較し、約10倍程度低下していた。一方Rasの、B-RafCRDおよびRaf-1CRDに対する結合力は同程度であった。以上の結果により、RasおよびRap1Aと、RafのCRDとの結合親和力を介するRafの活性調節機構、すなわちRafCRDとの強すぎる結合は活性を阻害し、適度な結合により活性化されるという機構を明らかにし得た。

The Ras effettor molecule, a cancer genetic product, is necessary for the activation of Raf and the combination of the two types. The first combination is the Ras effector domain, the Raf-1 Ras-Binding Domain (RBD) is the combination, the second combination is the Ras activation domain, and the Raf-Cysteine-Rich Domain(CRD)するものである. Rap1A has the same effector field as RBD, binding and activation of Raf-1, and Ras as activation and blocking of Raf-1.しかしB-Rafはactivationすることができる. I 々はRap1AがCRDとvery strong bindingし、このためRaf-1 activityをinhibitionすることを见出しており、This studyでは、Rap1AおよびRasと、 RafのCRDとのbinding affinity degreeによりRafのactivationとactivation hindranceがregulationされているとの仮说を立て、last yearまでに、Raf-1とB-RafのEach ドメインを exchanges the したkind 々のキメラ変 variant, the special にCRD を enters the れsubstitute えたキメラThe preparation of the allogeneic body, the results of the activity measurement, and the maintenance of B-RafCRD af-1はRap1Aによりactivatedされ, inverseにRaf-1のCRDをholdったB-RafはRap1AによりactivatedされなくなるというRESULTSている.さらにRaf-1およびB-RafのCRDにランダムに変differentImportしたプールを成し、その中からRasに対するcombinationはwild Type と同様であるが, Rap1A に対するcombination が嗗强しているB-Raf のCRD の変 variant, K252E/M278T し出た.この変 allogeneic のRas およびRap1A によるactivity をmeasurement したところ, Ras によるactivity は has するが, Rap1A によるactivity はdisappeared していた. This year's はさらにRaf-1CRDとB-RafCRDの、RasおよびRap1Aに対する knot Comparison of compatibility affinity and 32P ラベルしたGTP_γS using いることにより and quantitative measurement. As a result, the combination of Rap1A and B-RafCRD and the comparison of Raf-1CRD were about 10 times lower. The combination of Ras and B-RafCRD and Raf-1CRD have the same degree of binding strength. The above results are as follows: RasRap1A, RafCRD, Binding affinity, Raf activity regulator, The RafCRD has a strong combination of activity and resistance, a moderate combination of activation and activation, and a clear and clear structure.

项目成果

M.Goshima et al.: "Characterization of a novel Ras binding protein Ce-Fli-l comprising leucine rich repeats and gelsolin like domains" Biochemical and Biophysical Research Communications. (未定)(in press). (1999)

M. Goshima 等人：“包含富含亮氨酸重复序列和凝溶胶蛋白样结构域的新型 Ras 结合蛋白 Ce-Fli-1 的表征”《生物化学和生物物理研究通讯》（待定）（出版中）。

Yanhong Liao: "RA-GEF,a novel Rap1A guanine nucleotide exchange factor containing a Ras/Rap1A-associating domain,is conserved between nematode and humans"The Journal of Biological Chemistry. 274・53. 37815-37820 (1999)

廖彦宏：“RA-GEF，一种包含 Ras/Rap1A 相关结构域的新型 Rap1A 鸟嘌呤核苷酸交换因子，在线虫和人类之间是保守的”《生物化学杂志》274・53 (1999)。

Fumi Shima: "Association of yeast adenylyl cyclase with cyclase-associated protein CAP forms a second Ras-binding site witch mediates its Ras-dependent activation"Molecular and Cellular Biology. 20・1. 26-33 (2000)

Fumi Shima：“酵母腺苷酸环化酶与环化酶相关蛋白 CAP 的结合形成第二个 Ras 结合位点，介导其 Ras 依赖性激活”《分子与细胞生物学》20・1（2000 年）。

Tomoyo Okada: "The strength of interaction at Raf cysteine-rich domain is a critical determinant of response of Raf to Ras family small GTPases"Molecular and Cellular Biology. 19・9. 6057-6064 (1999)

Tomoyo Okada：“Raf 富含半胱氨酸结构域的相互作用强度是 Raf 对 Ras 家族小 GTP 酶反应的关键决定因素”《分子和细胞生物学》19·9。

Chang-Deng Hu: "Effect of Phosphorylation on Activities of Rap1A to Interact with Raf-1 and to Suppress Ras-dependent Raf-1 Activation." The Journal of Biological Chemistry. 274・1. 48-51 (1999)

胡长登：“磷酸化对 Rap1A 与 Raf-1 相互作用和抑制 Ras 依赖性 Raf-1 激活的影响”，《生物化学杂志》274・1（1999 年）。