ゲンジボタル・ルシフェラーゼ:反応中間複合体結晶の低温X線結晶構造解析

源氏萤火虫荧光素酶：反应中间体复合物晶体的低温X射线晶体结构分析

• 批准号: 12780451
• 负责人: 中津 亨
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: The Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780451/
• 关键词: ルシフェラーゼ; ルシフェリン; オキシルシフェリン; 生物発光; X線結晶構造解析; 反応中間複合体; ATP; デヒドロルシフェリン; 反応中間体

本研究の目的はゲンジボタルルシフェラーゼの発光反応現象を立体構造に基づき、その機構を明らかにすることである。ルシフェラーゼは最終生成物である励起されたオキシルシフェリンが基底状態に戻るときに緑色の発光を起こす。そこで今回は発光反応を終了させた構造、すなわちAMPとオキシルシフェリン複合体のX線結晶構造解析を行った。結晶化は沈殿剤にPEG4000、塩としてLiClを用いておこなった。得られた結晶のX線回折強度データの収集はSPring-8のビームラインBL45PXにおいて行い、1.6Å分解能の回折強度データが得られた。すでに得られているATP:デヒドロルシフェリン複合体の立体構造から電子密度図を計算したところ、オキシルシフェリンおよびAMPの電子密度がともに観測された。ATP:デヒドロルシフェリン複合体では、本来予想される結合様式ではない非選択的な構造が観測された。しかし今回の構造ではチアゾール官の酸素がAMPのαリン酸の近傍に位置し、ルシフェラーゼが本来持つルシフェリンの結合の様式を初めて明らかにした。またオキシルシフェリンのベンゾチアゾール官の窒素原子が水を介してルシフェラーゼと結合しており、ルシフェリンの認識に重要な結合であることが判明した。また発光色を決定している要因を探るために橙色に発光するSer286Asn変異体についても同様の複合体のX線結晶構造解析を行った。1.5分解能で構造を決定したところ、オキシルシフェリンの結合様式は野生型のときとは異なり、デヒドロルシフェリン複合体の時に見られた非選択的な反転した結合様式で結合していた。これは生成されたオキシルシフェリンが一旦酵素外に放出された後、もう一度酵素内に戻り活性を失活させると考えられた。このことはこの変異体が野生型に比べて発光の減衰が早いことを説明できると考えられる。

The purpose of this study is to clarify the light reflection phenomenon in the three-dimensional structure and mechanism. The final product is the base state, the green emission, and the green emission. The X-ray crystal structure analysis of the complex was carried out. Crystallization: PEG4000, LiCl The X-ray reflection intensity of the crystal was obtained. The reflection intensity of the crystal was obtained by SPring-8 and BL45 PX. The electron density of ATP and AMP in the three-dimensional structure of ATP and AMP was calculated. ATP: A complex of molecules that is not designed to be combined with a complex of molecules. The structure of this paper is based on the position of AMP in the vicinity of α-acid, and the combination of AMP and α-acid is based on the structure of AMP. It is important to recognize the importance of the combination of water and oxygen atoms in the understanding of water and oxygen. The X-ray crystal structure analysis of the complex of the same species was carried out. 1.5 Decomposition of the structure of the complex is determined by the combination of the wild type and the non-selective combination of the complex. The enzyme is released from the outside and inactivated from the inside. The wild type of the virus is different from the wild type of the virus

项目成果

Boehlein, S.K., Nakatsu, et al.: "Characterization of inhibitors acting at the synthetase site of Escherichia coli asparagine synthetase B"Biochemistry. 40・37. 11168-11175 (2001)

Boehlein, S.K., Nakatsu, et al.：“作用于大肠杆菌天冬酰胺合成酶 B 合成酶位点的抑制剂的特性”生物化学 40·37 (2001)。

Shimizu, T., Nakatsu, T., Miyairi, K., Okuno, T., Kato, H.: "Crystallization and preliminary X-ray study of endopolygalacturonase from the pathogenic fungus Stereum purpureum"Acta Crystallogr D. 57・8. 1171-1173 (2001)

清水T.、中津T.、宫入K.、奥野T.、加藤H.：“来自病原真菌Stereum purpureum的内聚半乳糖醛酸酶的结晶和初步X射线研究”Acta Crystallogr D. 57・8。 1171-1173 (2001)

Hibi, T., Hisada, H., Nakatsu, T., Kato, H., Oda, J.: "Escherichia coli B gamma-glutamylcysteine synthetase : modification, purification, cryst allization and preliminary cryst allographic analysis"Acta Crystallogr D. 58・2. 316-318 (2002)

Hibi, T.、Hisada, H.、Nakatsu, T.、Kato, H.、Oda, J.：“大肠杆菌 B γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶：修饰、纯化、结晶和初步晶体异质分析”Acta Crystallogr D.58・2。316-318（2002）