ゲンジボタル・ルシフェラーゼの発光反応中間状態構造の高分解能X線結晶構造解析

源氏萤荧光素酶发光反应中间态结构的高分辨率X射线晶体结构分析

• 批准号: 14780483
• 负责人: 中津 亨
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kyoto University (2003)The Institute of Physical and Chemical Research (2002)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780483/
• 关键词: ルシフェラーゼ; 生物発光; X線結晶構造解析; 中間体アナログ; ルシフェリン

ホタルのルシフェラーゼによる発光反応は発光基質であるルシフェリンがMgATPにより活性化され、Luciferyl AMP中間体を酵素中でいったん形成する。そこへ酸素が攻撃することにより、AMPが放出され、生成したオキシルシフェリンが励起状態から基底状態に移るときに発光が生じると考えられている。この発光反応のメカニズムを明らかにするときに鍵となるのは、いかにしてLueiferyl AMP中間体が生成され、どのような状態で存在しているかということである。しかしその中間状態をX線結晶構造解析により直接捕まえることは困難であった。そこで中間状態を明らかにするため、中間体のルシフェリン部分をデヒドロルシフェリン、リン酸基をスルファモイル基に変換したDehydroluciferyl Sulfamoyl Adenosine (DLSA)中間体アナログを合成した。そしてこの中間体アナログがルシフェラーゼ中でどのような構造をしているのかを明らかにするため、ルシフェラーゼ:DLSA複合体のX線結晶構造解析を行った。ルシフェラーゼとあらかじめインキュベートし、結晶化を行ったところ、PEG4000を沈殿剤として用いたときに良好な結晶が得られた。大型放射光施設SPring-8のビームラインBL45PXにおいてX線回折実験を行ったところ1.3Å分解能の回折強度データが得られ、精密化を行った結果、DLSAを示す非常にきれいな電子密度が得られた。その立体構造から中間体構造の安定化に寄与している残基としては近傍に存在するHisおよびThr残基が示唆された。また赤色発光を行う変異型酵素に関しても同様の立体構造決定を行い、野生型酵素との立体構造比較を行った。その結果、ルシフェリン付近のベータシート構造の位置が動いていることが判明し、この構造の違いが発光色の違いを反映している可能性が示唆された。

In the case of a light-emitting substrate, MgATP is activated and Luciferyl AMP is formed as an intermediate enzyme. For example, if a substance is released, the substance is released, the substance is excited, the substrate is shifted, and the substance is released. The intermediate of Lueiferyl AMP is produced and exists in its state. X-ray crystallographic analysis of intermediate states The intermediate state is clearly defined, and the intermediate part is synthesized by the reaction of the intermediate group with the intermediate group. The X-ray crystal structure analysis of DLSA complex was carried out. PEG4000 is a good crystallization material. The large scale radiation facility SPring-8 has been developed with the help of BL45PX. The X-ray reflection intensity of 1.3 μ m can be obtained with the help of DLSA. The stereostructure of the intermediate structure is stabilized by the presence of His and Thr residues. The red light is emitted by isoenzymes, which are related to the same stereostructure determination, and the wild type enzymes are compared with the stereostructure. As a result, the position of the nearest structure is changed, and the possibility of the structure's deviation from the light color is indicated.

项目成果

Matsubara M, Nakatsu T, Kato H, Taniguchi H: "Crystal structure of a myristoylated CAP-23/NAP-22 N-terminal domain complexed with Ca(2+)/calmodulin."EMBO Journal. 23(4). 712-718 (2004)

Matsubara M、Nakatsu T、Kato H、Taniguchi H：“与 Ca(2 )/钙调蛋白复合的肉豆蔻酰化 CAP-23/NAP-22 N 末端结构域的晶体结构。”EMBO 杂志。

Ifuku K, Nakatsu T, Kato H, Sato F.: "Crystal structure of the PsbP protein of photosystem II from Nicotiana tabacum"EMBO Report. (in press). (2004)

Ifuku K、Nakatsu T、Kato H、Sato F.：“烟草光系统 II 的 PsbP 蛋白的晶体结构”EMBO 报告。

Yamauchi, E., Nakatsu, T., Matsubara, M., Koto, H., Taniguchi H.: "Crystal structure of MARCKS calmodulin-binding domain peptide complexed with Ca^<2+> Calmodulin"Nature Structural Biology. (In press). (2003)

Yamauchi, E.、Nakatsu, T.、Matsubara, M.、Koto, H.、Taniguchi H.：“MARCKS 钙调蛋白结合域肽与 Ca^2 钙调蛋白复合的晶体结构”《自然结构生物学》。

Ifuku K, Nakatsu T, Kato H, Sato F.: "Crystallization and-preliminary crystallographic studies on the extrinsic 23kD protein in the oxygen-evolving complex of photosystem II."Acta Crystallogr D. 59(Pt8). 1462-1463 (2003)

Ifuku K、Nakatsu T、Kato H、Sato F.：“光系统 II 释氧复合物中外在 23kD 蛋白质的结晶和初步晶体学研究。”Acta Crystallogr D. 59（Pt8）。

Yamashita A, Endo M, Higashi T, Nakatsu T, Yamada Y, Oda J, Kato H.: "Capturing enzyme structure prior to reaction initiation : tropinone reductase-II-substrate complexes"Biochemistry. 42(19). 5566-5573 (2003)

Yamashita A、Endo M、Higashi T、Nakatsu T、Yamada Y、Oda J、Kato H.：“反应引发前捕获酶结构：托品酮还原酶-II-底物复合物”生物化学。