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膜結合型グルタミン酸受容体結合タンパク質PSD-zip45のX線結晶構造解析

膜结合谷氨酸受体结合蛋白PSD-zip45的X射线晶体结构分析

基本信息

批准号：
13033042
负责人：
中津亨
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、グルタミン酸受容体(mGluR)に結合するタンパク質であるPSD-Zip45のX線結晶構造解析を行い、情報伝達が行われるときの仕組みを立体構造に基づいて明らかにしようとするものである。PSD-Zip45はC末端領域にロイシンジッパーモチーフが存在し、この部分を用いて自己重合を行うことでmGluRをシナプス後膜に集積させる。シナプス後膜における受容体の集積機構の解明にはC末端領域は非常に重要である。しかし、その一方でこの領域は非常にアグリゲーションを起こしやすいために結晶化を行うための大量調整には困難な点も多い。我々のこれまでの研究で、PSD-zip45ファミリー内で保存されているN末端側186残基中、175残基までの領域についてX線結晶構造解析を行い、PSD-Zip45内の122残基以降の構造をとっていない領域の特定の部分(SPLTP配列)がmGluRへの結合領域であるEVH1ドメインと相互作用していることがわかった。このことからmGluRが存在することで、自己重合を開始する制御機構の存在が示唆された。そこで次に、この領域の水溶液中での挙動を調べるために、X線小角散乱により水溶液中でのこの領域の形状を測定した。その結果、分子の最大長が80Å程度であり分子のRcが9Å程度であることがわかった。この形状は構造をとっていない112残基以降の部分が自由に運動しているときの単量体分子の大きさによく一致した。このことは、結晶格子中で観察されたEVH1ドメインとSPLTP配列の相互作用が水溶液中では起きていないことを示していた。そこで、全体的な構造を明らかにするためにまずPSD-Zip45の全長の精製条件を検討した。その結果、精製バッファーに還元剤として2-メルカプトエタノールを添加することでPSD-Zip45の安定性が向上し、回収量及び精製純度が共に改善された。

The purpose of this study is to analyze the X-ray crystallographic structure of PSD-Zip45 in combination with mGluR, and to obtain information about the structure of the solid structure. PSD-Zip45 has a C-terminal domain that is present and partially overlapped with its own domain. The solution of the accumulation mechanism of the receptor after the membrane is very important. A large number of crystallization problems occurred in the field. In this study, X-ray crystallographic analysis of residues 186 and 175 on the N-terminal side of PSD-Zip 45 was carried out. Residues 122 in PSD-Zip45 were reduced in structure to a specific part of the domain (SPLTP alignment). The existence of the control mechanism is indicated by the existence of the GluR and the start of its own coincidence. The shape of this field in aqueous solution was determined by X-ray small angle scattering. The maximum length of the molecule is 80 degrees. The shape of the molecule is consistent with the structure of the molecule and the free movement of the 112 residues. The interaction between EVH1 and SPLTP is observed in the crystal lattice. Therefore, the entire structure is clear and the overall length of the PSD-Zip45 is refined. The stability, recovery and purity of the PSD-Zip45 were improved by the addition of the following components: