抗リン酸化PCM1モノクローナル抗体を用いた中心体構築機構の時空間的解析

目的 :中心体は微小管形成中心として機能する細胞小器官であり、染色体分配、発生、細胞運動や繊毛機能など様々な生命現象において極めて重要な機能を担っているが、その時空間的な構築機構については不明な点が多く残っている。本研究では、中心体複製の主要制御因子Plk4、中心体サテライト主要構成因子PCM1に焦点をあて、細胞周期G1期においてPlk4によるPCM1のリン酸化(S372)特異的に反応するモノクローナル抗体を作製し、中心体構築機構の時空間的な制御の解明を試みた。方法と結果 :申請者の所属する重井医学研究所によって独自に開発された、ラットリンパ節法を利用し、ラットモノクローナル抗体の作製を行った。S372を含むリン酸化ペプチドを抗原として用い、アジュバンドと共にラット3匹に免疫注射した。17日後に、リンパ節(リンパ球)を取り出し、電気融合によってミエローマ細胞と融合させた。その後、増殖細胞の培養上精を抗体として用いた。リン酸化および非リン酸化ペプチドを用いたELISA解析により、24個のポリクローナル抗体の候補を選抜した。その後、ミモシンを用いて細胞周期G1期に同調化した培養細胞(U20S)のサンプルを用い、ウエスタンブロットおよび免疫染色によるスクリーニングを行った。その結果、1つの候補を選抜した。このポリクローナル抗体による免疫染色では、ミモシン処理した細胞において、中心体周辺が染色された。しかし、無限希釈法によって、モノクローナル化を試みたが、抗体生産細胞の同定はできなかった。再度ラットへの免疫を行ったが、目的のモノクローナル抗体取得には至らなかった。本研究においては目的抗体の取得には至らなかったが、作製過程において得られた知見を元に、抗原および免疫動物種の変更などを再度検討し、抗体の作製さらに中心体の構築機構解明に取り組みたい。

目的 :中心体は微小管形成中心として機能する細胞小器官であり、染色体分配、発生、細胞運動や繊毛機能など様々な生命現象において極めて重要な機能を担っているが、その時空間的な構築機構については不明な点が多く残っている。本研究では、中心体複製の主要制御因子Plk4、中心体サテライト主要構成因子PCM1に焦点をあて、細胞周期G1期においてPlk4によるPCM1のリン酸化(S372)特異的に反応するモノクローナル抗体を作製し、中心体構築機構の時空間的な制御の解明を試みた。方法と結果 :申請者の所属する重井医学研究所によって独自に開発された、ラットリンパ節法を利用し、ラットモノクローナル抗体の作製を行った。S372を含むリン酸化ペプチドを抗原として用い、アジュバンドと共にラット3匹に免疫注射した。17日後に、リンパ節(リンパ球)を取り出し、電気融合によってミエローマ細胞と融合させた。その後、増殖細胞の培養上精を抗体として用いた。リン酸化および非リン酸化ペプチドを用いたELISA解析により、24個のポリクローナル抗体の候補を選抜した。その後、ミモシンを用いて細胞周期G1期に同調化した培養細胞(U20S)のサンプルを用い、ウエスタンブロットおよび免疫染色によるスクリーニングを行った。その結果、1つの候補を選抜した。このポリクローナル抗体による免疫染色では、ミモシン処理した細胞において、中心体周辺が染色された。しかし、無限希釈法によって、モノクローナル化を試みたが、抗体生産細胞の同定はできなかった。再度ラットへの免疫を行ったが、目的のモノクローナル抗体取得には至らなかった。本研究においては目的抗体の取得には至らなかったが、作製過程において得られた知見を元に、抗原および免疫動物種の変更などを再度検討し、抗体の作製さらに中心体の構築機構解明に取り組みたい。