新規カプシドを用いたAAVベクター効率的作製法確立と記憶学習制御

アデノ随伴ウィルス(AAV : adeno-associated virus)ベクターは、非病原性ウィルスで、かつ、神経細胞などの非分裂細胞に効率よく遺伝子導入できるため、非常に有用性が高いベクターである。また、AAVには、多くの血清型があり、その型により組織特異性が存在する。最近、多種の血清型を組み合わせたハイブリッドカプシドが開発された。これを用いて作製されたAAV2/DJは、様々な細胞・組織に高効率で遺伝子導入できることが知られている。当研究室では、これまで、血清型1型(AAV2/1)についてSf9細胞にて大量産生する系を構築した。そこで、今回、ハイブリッド血清型DJ(AAV2/DJ)他についても、Sf9系を駆使した、安価で簡便な高力価ウィルスの作出法の検討を行い、神経機能を高効率で操作するツールの開発をめざした。まず、新規AAVカプシドのAAV2/DJ、AAV2/2retroについて、Sf9細胞でAAVベクター作製に必要なコンポーネント(カプシドとAAV2複製酵素)を発現させるため、これらのバキュロウィルスを作成した。特に、カプシド3種類(VP1、VP2、VP3)の発現を1つのmRNA上で行うために、最適な開始コドン付近の配列を検討した。またこの時、1種類のバキュロウィルス上で、カプシドと複製酵素を発現させるデュアルカセットの系を用いた。続いて、目的遺伝子を含むバキュロウィルスとの二重感染の割合、及び精製方法を検討し、作製に成功した。次に、作製したウィルスをマウス脳への導入し、発現の確認と発現部位の検討を行った。

アデノ随伴ウィルス(AAV : adeno-associated virus)ベクターは、非病原性ウィルスで、かつ、神経細胞などの非分裂細胞に効率よく遺伝子導入できるため、非常に有用性が高いベクターである。また、AAVには、多くの血清型があり、その型により組織特異性が存在する。最近、多種の血清型を組み合わせたハイブリッドカプシドが開発された。これを用いて作製されたAAV2/DJは、様々な細胞・組織に高効率で遺伝子導入できることが知られている。当研究室では、これまで、血清型1型(AAV2/1)についてSf9細胞にて大量産生する系を構築した。そこで、今回、ハイブリッド血清型DJ(AAV2/DJ)他についても、Sf9系を駆使した、安価で簡便な高力価ウィルスの作出法の検討を行い、神経機能を高効率で操作するツールの開発をめざした。まず、新規AAVカプシドのAAV2/DJ、AAV2/2retroについて、Sf9細胞でAAVベクター作製に必要なコンポーネント(カプシドとAAV2複製酵素)を発現させるため、これらのバキュロウィルスを作成した。特に、カプシド3種類(VP1、VP2、VP3)の発現を1つのmRNA上で行うために、最適な開始コドン付近の配列を検討した。またこの時、1種類のバキュロウィルス上で、カプシドと複製酵素を発現させるデュアルカセットの系を用いた。続いて、目的遺伝子を含むバキュロウィルスとの二重感染の割合、及び精製方法を検討し、作製に成功した。次に、作製したウィルスをマウス脳への導入し、発現の確認と発現部位の検討を行った。