タンパク機能阻害と細胞種特異的機能回復を実現するウィルスベクター作成と最適化

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研究目的:RNA干渉(RNAi)のためshort hairpin RNA(shRNA)をレンチウィルスベクターにより細胞に発現させ、目的遺伝子機能を抑制する方法が非分裂細胞である神経細胞では用いられている。しかし、遺伝子機能を確定する上ではRNAi細胞へRNAi抵抗性cDNAを再導入し、この阻害効果が回復することを確認することが重要である。そこで、本研究では、同一レンチウィルスベクター上でshRNA発現による遺伝子抑制、RNAi抵抗性cDNA共発現による抑制の回復を効率良く行う系の確立を目的とした。研究方法および成果:初めに、shRNA発現用プロモーターと、標的遺伝子発現用として、構成的発現を誘導するプロモーター、あるいは神経細胞特異的発現を誘導するプロモーターをもつベクターを構築した。続いて、当研究室で研究している遺伝子CaMKIVのshRNAと可視化のためVenus cDNAを上記ベクターにより発現させ、CaMKIVの発現がある神経細胞あるいはCaMKlVを強制大量発現させた非神経細胞で、遺伝子発現阻害効果を検討した。その結果、神経細胞では感染7日後に50%の、非神経細胞では60%の発現抑制が確認された。次に上記プロモーター下にRNAi抵抗性cDNAを組み込んだものを用いて、発現回復を検討した。神経細胞において神経細胞特異的発現プロモーター下でのcDNA発現では、内在CaMKIV量と同等の発現回復がみられたが、他のプロモーターでは、5倍以上の過剰発現となり、また、グリア細胞にも多く発現してしまうことが確認された。現在、さらなる効果的な発現抑制、回復の条件を検討中である。また、この実験により、in vitroでレンチウィルスを用いた遺伝子抑制の効果を示すことができたので、今後、マウスを用いたin vivoの系に応用する予定である。