タンパク機能阻害と細胞種特異的機能回復を実現するウィルスベクター作成と最適化

创建和优化病毒载体，实现蛋白质功能抑制和细胞类型特异性功能恢复

• 批准号: 19924003
• 负责人: 岡村 理子
• 金额: $ 0.49万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19924003/
• 关键词: レンチウィルス; RNA干渉

研究目的:RNA干渉(RNAi)のためshort hairpin RNA(shRNA)をレンチウィルスベクターにより細胞に発現させ、目的遺伝子機能を抑制する方法が非分裂細胞である神経細胞では用いられている。しかし、遺伝子機能を確定する上ではRNAi細胞へRNAi抵抗性cDNAを再導入し、この阻害効果が回復することを確認することが重要である。そこで、本研究では、同一レンチウィルスベクター上でshRNA発現による遺伝子抑制、RNAi抵抗性cDNA共発現による抑制の回復を効率良く行う系の確立を目的とした。研究方法および成果:初めに、shRNA発現用プロモーターと、標的遺伝子発現用として、構成的発現を誘導するプロモーター、あるいは神経細胞特異的発現を誘導するプロモーターをもつベクターを構築した。続いて、当研究室で研究している遺伝子CaMKIVのshRNAと可視化のためVenus cDNAを上記ベクターにより発現させ、CaMKIVの発現がある神経細胞あるいはCaMKlVを強制大量発現させた非神経細胞で、遺伝子発現阻害効果を検討した。その結果、神経細胞では感染7日後に50%の、非神経細胞では60%の発現抑制が確認された。次に上記プロモーター下にRNAi抵抗性cDNAを組み込んだものを用いて、発現回復を検討した。神経細胞において神経細胞特異的発現プロモーター下でのcDNA発現では、内在CaMKIV量と同等の発現回復がみられたが、他のプロモーターでは、5倍以上の過剰発現となり、また、グリア細胞にも多く発現してしまうことが確認された。現在、さらなる効果的な発現抑制、回復の条件を検討中である。また、この実験により、in vitroでレンチウィルスを用いた遺伝子抑制の効果を示すことができたので、今後、マウスを用いたin vivoの系に応用する予定である。

The purpose of the study is to study the effect of RNA (RNAi) on short hairpin RNA (shRNA). The cell cycle was detected in the cell, and the sub-mechanism of the target was used to inhibit the growth of the cell. The sub-machine and sub-machine can confirm that the RNAi cell RNAi-resistant cDNA is reloaded, and then block the result. In this study, we found that there was a significant increase in the inhibition rate in shRNA and RNAi resistance cDNA in the same period of study. The results of the research methods are as follows: the first time, the first time, the first In the laboratory, when you study the CaMKIV shRNA, you can use the Venus cDNA to show that you have a problem, and that the CaMKIV shows that you have a large number of cells, which are caused by the presence of a large number of cells, and the results are blocked. The results showed that after 7 days of infection, 50% of the cells were infected, and 60% of the cells were inhibited. In the next step, the RNAi-resistant cDNA tissue was tested, and the response was detected. The amount of caMKIV is the same as that of cDNA. The amount of CaMKIV is more than 5 times higher than that of the same amount of CaMKIV. At present, there is a significant increase in the suppression and response of the results. In the future, the in vivo will be used in the future, and the in vivo will be used in the future.

项目成果

Regulation of dendritogenesis via a lipid-raft-associated Ca2+/calmodulin-dependent protei nkinase CLICK-III/CaMKl gamma

通过脂筏相关的 Ca2/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 CLICK-III/CaMKl gamma 调节树突发生

• 发表时间: 2007
• 期刊: Neuron 54
• 作者: Oikawa;M.;Smyth;J. M.;& Sliwinski;M.;及川昌典・及川晴・橋本絵美;及川昌典;及川昌典;及川昌典;及川昌典;及川昌典;及川昌典・及川晴・北村英哉(監訳);及川昌典;及川昌典;及川昌典;及川昌典;Mio Nonaka;Natsumi Ageta-Ishihara;井上昌俊;奥野浩行;Kawashima Takashi;尾藤 晴彦;Takemoto-Kimura S
• 通讯作者: Takemoto-Kimura S