テトラサイクリン応答システムを用いた誘導可能なタンパク機能阻害と回復系の確立

これまで、Creリコンビナーゼを用い、条件付RNA干渉法を行うベクター系を構築してきた。そこで本研究では、さらに発展させ、テトラサイクリン応答システムを利用し、特定の細胞で機能阻害を可能にするベクター開発を新たに目指した。具体的には、特異的プロモーターとテトラサイクリン応答システムを組み合わせ、単一細胞レベルで時期特異的・細胞系譜特異的に、RNA干渉法による機能阻害を実現する系の確立を実施した。まずテトラサイクリン応答性のRNA干渉実現のため、TRE(tetracycline response element)配列の下流にmiRNAを発現するベクターの構築を行った。さらに、Dox(ドキシサイクリン:テトラサイクリン誘導体)作用後に、RNA干渉を起こすshRNA配列が組み込まれたmiRNA配列と、緑色蛍光蛋白質(GFP)とが同一ベクター上で発現するdual cassetteベクターを構築した。続いて、独立した別のベクターとして、rtTA-Ad (reverse let-controlled transactivator-Advanced)を細胞種特異的に発現するベクターを作成した。具体的には、構成的発現プロモーター(CMVプロモーターおよびEF-1αプロモーター)、あるいは神経細胞特異的プロモーター(シナプシンIプロモーター)の下流でrtTA-Adを発現するベクターを構築した。培養細胞(HEK293T)において、上記の2種ベクター(dual cassetteベクターとrtTA-Ad発現ベクター)と目的遺伝子cDNAを含むベクターを発現させ、Doxを作用させたところ、Dox濃度依存的に目的遺伝子の発現抑制と遺伝子導入マーカーであるGFPの発現増加が、ウェスタンブロット法、免疫染色法にて確認できた。続いて、shRNA抵抗変異型cDNAベクターを作出し、このベクターのco-transfectionにより、発現抑制からの回復のための条件検討(Dox濃度の最適化、プロモーター強度の調整等)を進めた。

これまで、Creリコンビナーゼを用い、条件付RNA干渉法を行うベクター系を構築してきた。そこで本研究では、さらに発展させ、テトラサイクリン応答システムを利用し、特定の細胞で機能阻害を可能にするベクター開発を新たに目指した。具体的には、特異的プロモーターとテトラサイクリン応答システムを組み合わせ、単一細胞レベルで時期特異的・細胞系譜特異的に、RNA干渉法による機能阻害を実現する系の確立を実施した。まずテトラサイクリン応答性のRNA干渉実現のため、TRE(tetracycline response element)配列の下流にmiRNAを発現するベクターの構築を行った。さらに、Dox(ドキシサイクリン:テトラサイクリン誘導体)作用後に、RNA干渉を起こすshRNA配列が組み込まれたmiRNA配列と、緑色蛍光蛋白質(GFP)とが同一ベクター上で発現するdual cassetteベクターを構築した。続いて、独立した別のベクターとして、rtTA-Ad (reverse let-controlled transactivator-Advanced)を細胞種特異的に発現するベクターを作成した。具体的には、構成的発現プロモーター(CMVプロモーターおよびEF-1αプロモーター)、あるいは神経細胞特異的プロモーター(シナプシンIプロモーター)の下流でrtTA-Adを発現するベクターを構築した。培養細胞(HEK293T)において、上記の2種ベクター(dual cassetteベクターとrtTA-Ad発現ベクター)と目的遺伝子cDNAを含むベクターを発現させ、Doxを作用させたところ、Dox濃度依存的に目的遺伝子の発現抑制と遺伝子導入マーカーであるGFPの発現増加が、ウェスタンブロット法、免疫染色法にて確認できた。続いて、shRNA抵抗変異型cDNAベクターを作出し、このベクターのco-transfectionにより、発現抑制からの回復のための条件検討(Dox濃度の最適化、プロモーター強度の調整等)を進めた。